xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)低毒性X-tremeGENE DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

 

 

X-tremeGENE DNA Transfection Reagent是一種非脂質(zhì)體、多組分轉(zhuǎn)染試劑，已被證明可有效轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP在有無(wú)血清條件下均可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)染后無(wú)需更換培養(yǎng)基。

 

降低轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)是非常重要的：

■   在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保證轉(zhuǎn)染目標(biāo)基因的高表達(dá)率

■   減少死細(xì)胞數(shù)目及其釋放的蛋白酶，能高表達(dá)未被消化的目的重組蛋白。

■   獲得同轉(zhuǎn)染目標(biāo)基因生物相關(guān)的結(jié)果

 

本研究中，在Hela細(xì)胞上進(jìn)行了X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HPTransfection Reagent的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，并與其他試劑進(jìn)行了比較。

 

 

■   細(xì)胞毒性使用xCELLigence RTCA MP儀器進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定電阻抗，可長(zhǎng)時(shí)間、無(wú)標(biāo)記、動(dòng)態(tài)監(jiān)控細(xì)胞生理活動(dòng)，包括細(xì)胞黏附、伸展、增殖、死亡以及其他形態(tài)變化。新推出的配套耗材E-plate VIEW 96每個(gè)孔下部有0.5mm透明的窗口，可完成可視化的精微檢查。

 

■  羅氏自動(dòng)化圖像捕獲和分析系統(tǒng)Cellavista，其為結(jié)合可見(jiàn)光和熒光成像優(yōu)點(diǎn)的全自動(dòng)、高通量精微細(xì)胞圖像分析工作站，在實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

 

■  細(xì)胞代謝活動(dòng)可由WST-1細(xì)胞增殖試劑盒分析檢測(cè)，定量活性細(xì)胞的代謝活力。

 

 

■  xCELLigence RTCA MP儀器的連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示，使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela細(xì)胞上轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)質(zhì)粒，與未處理對(duì)照組的細(xì)胞指數(shù)（Cell Index, CI）值是相似的（圖1）。而其他試劑在轉(zhuǎn)染5個(gè)小時(shí)后，細(xì)胞指數(shù)值有明顯的下降，表明存在細(xì)胞毒性。

圖1: 使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其爭(zhēng)轉(zhuǎn)染試劑在Hela細(xì)胞上轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)質(zhì)粒后，xCELLigence 檢測(cè)的細(xì)胞指數(shù)變化曲線圖。

圖2：Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)。可見(jiàn)光圖像由Cellavist儀器獲得（10倍放大）

 

■  Cellavist可視化檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)染24h后獲得可見(jiàn)光成像圖。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞呈現(xiàn)健康狀態(tài)，而其他試劑組則存在大量死亡細(xì)胞（圖2）。

 

■  終點(diǎn)法分析，轉(zhuǎn)染約72h后通過(guò)細(xì)胞增殖試劑盒WST-1分析確定細(xì)胞活性（圖3）。與X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent相比，其他試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，顯著降低代謝活力，顯示出細(xì)胞毒性效應(yīng)。

圖3：比較羅氏X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP 與其試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞活力的百分比。WST-1試劑盒檢測(cè)得出數(shù)值，并以X-tremeGENE 9組結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

 

 

■  為獲得X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其他試劑轉(zhuǎn)染后，表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)目，Cellavista在指定時(shí)間點(diǎn)記錄熒光圖像（圖4）。并利用Cellavista圖像分析軟件，根據(jù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞面積（熒光圖像）與總的細(xì)胞面積（相應(yīng)的可見(jiàn)光圖像，未顯示）進(jìn)行定量，數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖5。在觀察過(guò)程中得出，X-tremeGENE試劑有更高的轉(zhuǎn)染效率。

圖4 ：X-tremeGENE Transfection Reagent轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)大量GFP。轉(zhuǎn)染48h后，Cellavista記錄的細(xì)胞表達(dá)GFP的熒光圖像（10倍放大）。

圖5：GFP表達(dá)水平定量。Cellavista分析軟件統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h后的轉(zhuǎn)染效率百分?jǐn)?shù)（以X-tremeGENE 9 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染24h后獲得的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化）。

 

 

X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela細(xì)胞系的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)上，表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和高DNA轉(zhuǎn)染效率。xCELLigence RTCA MP也是理想的適合實(shí)時(shí)檢測(cè)試劑特異性效應(yīng)的儀器。

 

 

 

Hela細(xì)胞（ATCC）接種在合適的含附加成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并在37℃，5%CO₂ 濕潤(rùn)環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化、清洗并接種在E-Plate VIEW 96上。

 

接種24小時(shí)后，分別用三種轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE 9、X-tremeGENE HP以及其他試劑（LTX和L2K），轉(zhuǎn)染CMV啟動(dòng)子的GFP-pcDNA3.1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染根據(jù)指導(dǎo)手冊(cè)說(shuō)明，采用各說(shuō)明書(shū)建議的最適DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

 

xCELLigence RTCA MP儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)全程細(xì)胞狀態(tài)（從細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)染后三天）。測(cè)定每孔50 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基的值作為背景電阻抗。每孔最終體積調(diào)整至100 μl，密度為4000個(gè)Hela細(xì)胞。接種后，電阻抗以固定時(shí)間間隔被測(cè)定。細(xì)胞指數(shù)（CI）值以轉(zhuǎn)染時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

 

Cellavista系統(tǒng)高通量顯微鏡可在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中指定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行操作。xCELLigence 系統(tǒng)測(cè)定可短暫暫停，E-Plate VIEW 96可轉(zhuǎn)化進(jìn)Cellavista系統(tǒng)中。通過(guò)10倍物鏡可獲得所有96孔板的可見(jiàn)光和熒光圖像。轉(zhuǎn)染效率可使用Cellavista軟件分析獲得。獲取圖像后，E-Plate VIEW 96返回xCELLigence RTCA MP儀器中，細(xì)胞電阻測(cè)定可重新開(kāi)始。

 

細(xì)胞活性可使用WST-1細(xì)胞增殖試劑盒(羅氏應(yīng)用科學(xué))在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)測(cè)定（轉(zhuǎn)染后72小時(shí)），參見(jiàn)操作說(shuō)明。