單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的原理、方法與應(yīng)用分析

實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需克服兩大核心技術(shù)挑戰(zhàn)：

1. PCR擴(kuò)增偏差控制
單個(gè)細(xì)胞僅含約10 pg總RNA，其中mRNA含量更低。為達(dá)到測(cè)序所需的核酸量，擴(kuò)增倍數(shù)需超過百萬倍。在此過程中，即使微小的擴(kuò)增效率差異也會(huì)在指數(shù)擴(kuò)增后被顯著放大。理論計(jì)算表明，若兩個(gè)表達(dá)量相同的基因在擴(kuò)增效率上僅存在2%的差異（99% vs 97%），經(jīng)過30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，最終產(chǎn)物量將產(chǎn)生1.84倍的差異，可能造成假陽性差異表達(dá)結(jié)果。

2. rRNA干擾消除
核糖體RNA在總RNA中占比通常超過80%。若不對(duì)其進(jìn)行有效去除，測(cè)序數(shù)據(jù)將嚴(yán)重偏向rRNA序列，大幅降低有效信息獲取效率，增加測(cè)序成本。

1. SMART擴(kuò)增技術(shù)
SMART技術(shù)通過設(shè)計(jì)特殊引物系統(tǒng)與MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的獨(dú)特特性相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高效的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增。

核心技術(shù)特征：
特殊Oligo(dT)引物：在PolyT序列3'端設(shè)置特定簡(jiǎn)并堿基，確保引物精確結(jié)合于mRNA poly(A)尾起始處
模板末端轉(zhuǎn)移活性：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在完成逆轉(zhuǎn)錄后，可在新生cDNA的3'端添加非模板依賴的胞嘧啶殘基
模板轉(zhuǎn)換機(jī)制：含有核糖核酸鳥嘌呤的通用引物與添加的C殘基互補(bǔ)，引導(dǎo)酶進(jìn)行第二鏈合成
均一擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)：兩端引入通用引物序列，實(shí)現(xiàn)后續(xù)PCR的均一擴(kuò)增

技術(shù)局限：
主要捕獲mRNA信息，非編碼RNA（如lncRNA）大量丟失
對(duì)RNA完整性要求較高，降解導(dǎo)致5'端信息缺失
缺乏分子標(biāo)簽系統(tǒng)，無法區(qū)分PCR重復(fù)與真實(shí)生物變異

2. 10× Genomics技術(shù)
基于微流控與油滴包被系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞捕獲與標(biāo)記。

核心技術(shù)特征：
凝膠微珠系統(tǒng)：每個(gè)微珠包含獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（16bp Barcode）與唯一分子標(biāo)識(shí)（10bp UMI）
高通量捕獲：通過油包水微滴實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞與單個(gè)微珠的精準(zhǔn)配對(duì)
分子計(jì)數(shù)準(zhǔn)確：UMI系統(tǒng)可區(qū)分PCR擴(kuò)增重復(fù)與原始轉(zhuǎn)錄本，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量
大規(guī)模并行：?jiǎn)未螌?shí)驗(yàn)可同時(shí)分析數(shù)千至上萬個(gè)細(xì)胞

技術(shù)局限：
主要針對(duì)poly(A)+ RNA，lncRNA捕獲效率有限
RNA降解影響5'端完整性
平臺(tái)依賴性較強(qiáng)，設(shè)備投入成本較高

3. AnyDeplete技術(shù)
采用隨機(jī)引物啟動(dòng)與選擇性去除策略，提高技術(shù)適應(yīng)性。

核心技術(shù)特征：
隨機(jī)引物啟動(dòng)：不依賴poly(A)尾，可捕獲包括非編碼RNA在內(nèi)的多種RNA類型
鏈特異性建庫：通過核苷酸類似物標(biāo)記實(shí)現(xiàn)鏈來源區(qū)分
選擇性去除：利用特異性探針與酶切系統(tǒng)選擇性消除rRNA衍生的cDNA
降解樣本兼容：對(duì)RNA完整性要求較低，適用于部分降解樣本

技術(shù)局限：
當(dāng)僅需mRNA信息時(shí)，部分測(cè)序通量被非編碼RNA占據(jù)
實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜
數(shù)據(jù)分析需考慮鏈特異性信息

2. 分析算法優(yōu)化
批次效應(yīng)校正方法的完善
細(xì)胞類型注釋的標(biāo)準(zhǔn)化
軌跡推斷算法的精度提升

3. 臨床應(yīng)用拓展
腫瘤異質(zhì)性圖譜構(gòu)建
免疫細(xì)胞狀態(tài)分析
發(fā)育生物學(xué)研究

4. 技術(shù)瓶頸突破
超低起始量RNA的穩(wěn)定擴(kuò)增
全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的高效捕獲
成本效益的持續(xù)優(yōu)化

未來技術(shù)發(fā)展將更加注重：技術(shù)整合：結(jié)合不同技術(shù)優(yōu)勢(shì)，開發(fā)混合策略。標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)：建立統(tǒng)一的數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。臨床應(yīng)用：推動(dòng)技術(shù)向臨床診斷和治療監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化。計(jì)算創(chuàng)新：開發(fā)更強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析工具和算法

隨著技術(shù)進(jìn)步和成本降低，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有望成為常規(guī)研究工具，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)和基礎(chǔ)研究中發(fā)揮更大作用。研究者在選擇技術(shù)時(shí)應(yīng)綜合考慮樣本特性、研究目標(biāo)、通量需求和成本預(yù)算，以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。

六、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)哪里有？
LabEx提供單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq），scRNA-seq利用磁珠+寡核苷酸的偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，寡核苷酸的結(jié)構(gòu)分為4個(gè)組成部分：PCR引物結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞條形碼、分子標(biāo)簽和poly-dT序列。通過A-T互補(bǔ)配對(duì)的方式，捕獲并標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞釋放出的帶有polyA尾巴的mRNA分子，最終利用高通量測(cè)序反映每個(gè)細(xì)胞的各個(gè)基因的mRNA含量。

樂備實(shí)是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。