肉類顏色測量指南之新鮮肉中的肌紅蛋白氧化還原形式
肉類顏色測量指南
新鮮肉中的肌紅蛋白氧化還原形式
反射率測量與眼睛和大腦感知密切相關。通過這種非破壞性采樣方法，可以在同一樣本上進行多次隨時間變化的測量。此外，該程序快速且易于操作。
然而，由于反射率測量受肌肉結構、表面濕度、脂肪含量、色素濃度、pH值及其他固有肌肉特性等因素影響，需要格外注意細節。本節概述了特定肌紅蛋白形式的定量分析。
目前有兩種反射率法可用于定量肌紅蛋白氧化還原形式。第一種方法通過表面反射率計算各氧化還原形式在等波長下的 K/S 比值（Francis和Clydesdale，1975）。第二種方法采用選定波長與校正因子（Krzywicki，1979），通過計算脫鎂肌紅蛋白（DMb）和鎂鎂結合肌紅蛋白（MMb）的百分比，并以100%為基準確定氧化肌紅蛋白（OMb）的含量。
估算DMb、OMb和MMb（以及相應的血紅蛋白形式）對肉類色素穩定性的基礎研究至關重要。不過，Ledward（1970）指出，通過反射率估算的色素化學形態準確度僅±6%或7%。 AMSA 網站上可獲取DMb、OMb、COMb和MMb的數碼照片。
A. K/S方法用于等波長測量
在等波長點（即三種肌紅蛋白形式中兩種或以上具有相同反射率的波長，參見圖9.1）處測量的肉樣表面反射率，需轉換為 K/S 值（計算方法詳見C節，Judd和Wyszecki，1963）。將反射率轉換為 K/S 值能提升數據線性度，同時有助于校正肉品的散射特性（S =散射系數）和吸收特性（K =吸光系數）（Francis和Clydesdale，1975）。樣本的 K/S 值需代入方程計算，這要求必須預先確定三種主要肉品色素形式100%的參考值。需注意的是，每種100%肌紅蛋白形式的 K/S 參考值會因實驗條件、包裝方式、樣本特性及儀器差異而有所不同。因此，研究人員應通過實驗樣本自行測定100%參考值，而非直接采用已發表的數值。
B.創建“100%”肌紅蛋白氧化還原形式作為參考標準
要定量測定肉品表面肌紅蛋白氧化還原態的含量，必須獲取各色素形態在等比波長處的分光光度反射值（圖9.1）。由于不同氧化還原態之間可快速相互轉化，制備由“100%”去肌紅蛋白（DMb）、氧化肌紅蛋白（OMb）、微氧化肌紅蛋白（MMb）或完全氧化肌紅蛋白（COMb）組成的參考標準品并非易事，需特別注意。這些形態可通過化學誘導或調節氧分壓來實現。掃描100%標準品時，所有樣本都應使用同一包裝膜進行掃描，以消除反射率變化的潛在干擾源。 若樣本充足，建議專門留出整塊肉樣（如肉排或牛排）用于色素形態檢測。
1. 與肌紅蛋白。
選擇以下方法之一。
a. 化學誘導處理：將樣本浸入1.0%鐵氰化鉀溶液1分鐘，瀝干后用布吸干表面，用透氣膜封裝后置于2-4℃、1%氧氣環境中氧化48小時或更長時間，以最大限度形成MMb后再進行掃描。若肉類為“新鮮”狀態，MMb可能僅在表面及淺層形成，因此無法獲得最完整的反射掃描圖像。建議選用死后較久的肉類進行處理，因其固有的還原活性較低。
b. 氧分壓調控：建議從DMb狀態的肉開始操作。與完整肉相比，絞肉中高鐵肌紅蛋白的形成速度通常更快（可能由于耗氧量更高和/或MMb還原程度更低）。將肉置于氧氣阻隔袋中，以1%氧氣和99%氮氣的混合氣體環境，在室溫（約20℃）下儲存6小時；隨后測量袋內氧含量（目標是將組織氧含量降至1%，該過程在較高溫度下會更快完成）。若
新鮮肉中肌紅蛋白氧化還原形式的定量方程式
當殘留氧含量低于1%時，需通過以下步驟提升：使用自密封隔膜、注射器和細針，向氧氣阻隔袋注入已知體積的大氣空氣（氧氣濃度約20.6%）。根據袋體容積和已知氧濃度，運用公式（袋容積×袋內殘留氧濃度）調整至[目標容積×目標氧濃度（1%）]。若氧濃度超過1%，需進行額外沖洗。建議采用3：1或更高的氣體與肉類比例，以防止儲存期間肌紅蛋白降解。肉類初始吸收的氧氣越少，轉化效率越高；應定期檢測并調整殘留氧濃度。需維持至少1%的氧濃度。
需在4°C環境下靜置48小時或更長時間，以確保完全形成100%的成熟肌紅蛋白（MMb）。當色素完全轉化后，重新用透氣薄膜包裹并掃描檢測MMb含量。使用儲存或陳化且肌紅蛋白還原酶活性較低的肉類，可加速MMb的形成。新鮮肉類可能需要長達一周時間才會變褐。儲存期間需密切監測氧氣濃度及褐變進程。
c. 為將混合物中的色素轉化為MMb，需將肉塊裝入袋中，用搟面杖壓平（搟面杖厚度需薄到足以讓改良氣體滲透超過肉塊厚度的50%），抽空袋內空氣后充入100%氮氣，按前述方法將殘留氧含量調整至1%。將袋子單面朝下存放進行色素轉化。轉化進行到一半時，將改良氣體包裝袋翻轉，使肉塊另一面暴露于氣體環境中。在4℃環境下放置48小時后，重新用透氣膜包裹，并對多個表面進行MMb檢測掃描。
2. 去氧肌紅蛋白。
選擇以下方法之一。
a. 化學誘導法：將尺寸一致的樣品浸入0.15%的二硫代硫酸鈉溶液中將樣品置于室溫（約20°C）下靜置1-2分鐘，排液后用吸水紙吸干表面，進行真空包裝，隨后在20°C環境中靜置1-2小時以最大限度轉化為DMb。使用與第1、3節檢測肌紅蛋白形態時相同的透氧薄膜重新封裝，并立即進行掃描。研磨后的產物可置于燒杯中的濾網支撐。
b. 氧分壓調控：在樣品內表面制備新鮮切面，確保其脫氧肌紅蛋白含量基本達到100%，并立即進行掃描，通常僅需一次即可完成。由于脫氧肌紅蛋白難以在100%濃度下穩定保留。
c. 或者與步驟2b聯合操作：將樣品置于高阻氧真空袋中進行真空包裝（需使用極高真空度以最大限度減少殘留氧氣），并在4℃環境下保存24至48小時。OMb向DMb的轉化可能較為緩慢，特別是在-1至4℃溫度區間。若將樣品在20℃條件下保持至少50%的時間，可促進OMb向DMb的更完全轉化。通常情況下，由于氧氣分壓較低，OMb會優先轉化為MMb，隨后MMb會逐漸轉化為DMb。若儀器已使用覆蓋瓷磚標準的阻氧膜進行標準化，可直接掃描真空包裝膜以減少OMb生成。但若研究人員希望保持三種肌紅蛋白形態的膜層一致性，則需使用覆蓋標準膜的透氣膜進行標準化。此時應立即從真空包裝中取出樣品，覆蓋透氣膜并馬上進行掃描。
3. 氧合血紅蛋白。
a. 氧氣分壓調控：將先前保存在0至2℃環境中的樣品置于高氧環境中（如炸彈式量熱儀或改良型氣氛包裝袋），用70%至100%的氧氣沖洗后，于0至2℃條件下儲存24至48小時。取出樣品后立即進行掃描。若樣品采用高氧改良氣氛包裝，需確保氣體與肉體積比至少為3：1。對于研磨產品，應采用薄層包裝以促進改良氣氛包裝袋中的氧氣吸收。
b. pH值越高，就越難獲得最大開花（充氧）。
c. 儲存溫度越低，氧與肌紅蛋白的結合就越強，因為酶對氧的競爭越少。
4. 羧基肌紅蛋白。
a. 使用CO時需謹慎。
b. 建議從處于DMb狀態的肉類開始處理，因為CO不太可能與OMb和MMb結合。例如，真空包裝或使用除氧劑的肉類效果更佳，因為微量氧氣就能延緩COMb的形成。
c. 在填充已知濃度的氣體后，應立即對包裝的頂空進行預混處理（使用指定濃度的一氧化碳）或注入計算量的純一氧化碳。隨后將肉品置于改良氣體環境中儲存，該環境含0.4%至1.0%的一氧化碳，余量為氮氣或二氧化碳與氮氣的混合氣體。
d. 在測量表面形成的COMb之前，應將包裝儲存需在4℃條件下持續2至3天，以促進氧氣（及有機物）的去除，并使金屬有機物完全還原為金屬有機化合物，從而確保表面約100%的色素轉化為共價有機物。
c. 通過K/S比值計算肌紅蛋白形式
當肌紅蛋白完全轉化為四種色素形態后，需分別記錄474、525、572和610納米波長下的反射率數據。雖然理想情況下所有掃描應使用同一包裝膜，但實際操作中可能因制備方法不同而無法實現。隨后使用以下公式將反射率百分比轉換為 K/S 值：
K/S =（1−R）（1−R）÷（2R），
其中R表示反射率百分比（需以小數形式呈現）。例如當反射率為30%時，取0.30代入計算，K/S 值應為0.8167。由于多數反射率儀器僅以10納米為間隔記錄數據，因此需通過積分法計算：474納米處使用470和480納米波長積分，525納米處使用520和530納米波長積分，572納米處使用570和580納米波長積分。首先通過積分法計算各波長的反射率值，再將其轉換為 K/S 值。
將這些100%的參考 K/S 值與樣品 K/S 值代入相應公式后，即可計算出樣品表面的脫鎂肌紅蛋白（DMb）、脫鎂肌紅蛋白（OMb）或脫鎂肌紅蛋白（MMb）的百分比。關于肌紅蛋白形態的估算公式，Hunt（1980）曾做過系統總結。文獻中關于脫氧肌紅蛋白和MMb的測定方法屢見不鮮，而脫鎂肌紅蛋白的百分比通常通過100%的差值來確定。不過，由于脫鎂肌紅蛋白含量與消費者偏好密切相關（Hunt），更推薦直接使用610納米波長進行測定（Mancini等，2003），因為該波長對DMb和MMb都具有等比特性。（Kropf，1988）。在計算DMb、OMb和MMb的百分比時，其總和可能不等于100%。若出現這種情況，可參考Mancini等人（2003）提出的處理方法。在許多即食包裝產品中，可通過添加乳酸等多種成分進行改良。由于肉類的反射特性可能受鹽分及其他成分影響（Lamkey等，1986；Swatland和Barbut，1999），因此需要為每種肌紅蛋白形態的100%含量建立參考標準，并進行方程式依賴性計算。為最大限度提高改良產品表面肌紅蛋白氧化還原形態的估算精度，應專門從改良產品中提取100%去甲肌紅蛋白（DMb）、去甲肌紅蛋白（OMb）和肌紅蛋白（MMb）的參考標準（Ramanathan等，2010）。
目前尚無可用于估算肉表面COMb的反射率測量方法。不過，暴露于一氧化碳的牛排光譜特征顯示，COMb在500納米處存在反射峰，且在420納米處呈現Soret吸收峰（Wolfe等人，1978；Ramanathan等人，2010）。金槍魚肌肉的類似結果也已被記錄（Smulevich等人，2007）。Suman等人（2006）發表了純化牛COMb溶液的吸收光譜數據，并得出結論：通過543納米處吸收值與581納米處吸收值的比值，可區分COMb與OMb。此外，100% COMb樣品在503納米處還顯示出明顯的吸收谷。
D. 通過選定波長計算肌紅蛋白形態
克日維茨基（1979年）提出了一種替代 K/S 比值法測定肌紅蛋白形態的新方法。該方法無需完全轉化色素成分，具有顯著優勢。具體操作時，先測定脫氧肌紅蛋白和MMb的含量，再通過100%總含量減去兩者的百分比，間接計算出OMb的含量。該方法基于以下原理：反射衰減(A)是反射率倒數的對數值。反射率在等滲波長474、525和572納米以及730納米處測量，其中730納米的反射率被稱為無色素肉的反射率。部分儀器未在730納米處測量反射率，此時可采用700納米或更接近730納米的波長進行測量。根據公式1將反射率(R)轉換為反射衰減值(A)，并將A值代入公式2計算MMb，代入公式3計算DMb。氧合血紅蛋白的計算采用公式4：
新鮮肉中的肌紅蛋白氧化還原形式
反射率測量與眼睛和大腦感知密切相關。通過這種非破壞性采樣方法，可以在同一樣本上進行多次隨時間變化的測量。此外，該程序快速且易于操作。
然而，由于反射率測量受肌肉結構、表面濕度、脂肪含量、色素濃度、pH值及其他固有肌肉特性等因素影響，需要格外注意細節。本節概述了特定肌紅蛋白形式的定量分析。
目前有兩種反射率法可用于定量肌紅蛋白氧化還原形式。第一種方法通過表面反射率計算各氧化還原形式在等波長下的 K/S 比值（Francis和Clydesdale，1975）。第二種方法采用選定波長與校正因子（Krzywicki，1979），通過計算脫鎂肌紅蛋白（DMb）和鎂鎂結合肌紅蛋白（MMb）的百分比，并以100%為基準確定氧化肌紅蛋白（OMb）的含量。
估算DMb、OMb和MMb（以及相應的血紅蛋白形式）對肉類色素穩定性的基礎研究至關重要。不過，Ledward（1970）指出，通過反射率估算的色素化學形態準確度僅±6%或7%。 AMSA 網站上可獲取DMb、OMb、COMb和MMb的數碼照片。
A. K/S方法用于等波長測量
在等波長點（即三種肌紅蛋白形式中兩種或以上具有相同反射率的波長，參見圖9.1）處測量的肉樣表面反射率，需轉換為 K/S 值（計算方法詳見C節，Judd和Wyszecki，1963）。將反射率轉換為 K/S 值能提升數據線性度，同時有助于校正肉品的散射特性（S =散射系數）和吸收特性（K =吸光系數）（Francis和Clydesdale，1975）。樣本的 K/S 值需代入方程計算，這要求必須預先確定三種主要肉品色素形式100%的參考值。需注意的是，每種100%肌紅蛋白形式的 K/S 參考值會因實驗條件、包裝方式、樣本特性及儀器差異而有所不同。因此，研究人員應通過實驗樣本自行測定100%參考值，而非直接采用已發表的數值。
B.創建“100%”肌紅蛋白氧化還原形式作為參考標準
要定量測定肉品表面肌紅蛋白氧化還原態的含量，必須獲取各色素形態在等比波長處的分光光度反射值（圖9.1）。由于不同氧化還原態之間可快速相互轉化，制備由“100%”去肌紅蛋白（DMb）、氧化肌紅蛋白（OMb）、微氧化肌紅蛋白（MMb）或完全氧化肌紅蛋白（COMb）組成的參考標準品并非易事，需特別注意。這些形態可通過化學誘導或調節氧分壓來實現。掃描100%標準品時，所有樣本都應使用同一包裝膜進行掃描，以消除反射率變化的潛在干擾源。 若樣本充足，建議專門留出整塊肉樣（如肉排或牛排）用于色素形態檢測。
1. 與肌紅蛋白。
選擇以下方法之一。
a. 化學誘導處理：將樣本浸入1.0%鐵氰化鉀溶液1分鐘，瀝干后用布吸干表面，用透氣膜封裝后置于2-4℃、1%氧氣環境中氧化48小時或更長時間，以最大限度形成MMb后再進行掃描。若肉類為“新鮮”狀態，MMb可能僅在表面及淺層形成，因此無法獲得最完整的反射掃描圖像。建議選用死后較久的肉類進行處理，因其固有的還原活性較低。
b. 氧分壓調控：建議從DMb狀態的肉開始操作。與完整肉相比，絞肉中高鐵肌紅蛋白的形成速度通常更快（可能由于耗氧量更高和/或MMb還原程度更低）。將肉置于氧氣阻隔袋中，以1%氧氣和99%氮氣的混合氣體環境，在室溫（約20℃）下儲存6小時；隨后測量袋內氧含量（目標是將組織氧含量降至1%，該過程在較高溫度下會更快完成）。若
新鮮肉中肌紅蛋白氧化還原形式的定量方程式
當殘留氧含量低于1%時，需通過以下步驟提升：使用自密封隔膜、注射器和細針，向氧氣阻隔袋注入已知體積的大氣空氣（氧氣濃度約20.6%）。根據袋體容積和已知氧濃度，運用公式（袋容積×袋內殘留氧濃度）調整至[目標容積×目標氧濃度（1%）]。若氧濃度超過1%，需進行額外沖洗。建議采用3：1或更高的氣體與肉類比例，以防止儲存期間肌紅蛋白降解。肉類初始吸收的氧氣越少，轉化效率越高；應定期檢測并調整殘留氧濃度。需維持至少1%的氧濃度。
需在4°C環境下靜置48小時或更長時間，以確保完全形成100%的成熟肌紅蛋白（MMb）。當色素完全轉化后，重新用透氣薄膜包裹并掃描檢測MMb含量。使用儲存或陳化且肌紅蛋白還原酶活性較低的肉類，可加速MMb的形成。新鮮肉類可能需要長達一周時間才會變褐。儲存期間需密切監測氧氣濃度及褐變進程。
c. 為將混合物中的色素轉化為MMb，需將肉塊裝入袋中，用搟面杖壓平（搟面杖厚度需薄到足以讓改良氣體滲透超過肉塊厚度的50%），抽空袋內空氣后充入100%氮氣，按前述方法將殘留氧含量調整至1%。將袋子單面朝下存放進行色素轉化。轉化進行到一半時，將改良氣體包裝袋翻轉，使肉塊另一面暴露于氣體環境中。在4℃環境下放置48小時后，重新用透氣膜包裹，并對多個表面進行MMb檢測掃描。
2. 去氧肌紅蛋白。
選擇以下方法之一。
a. 化學誘導法：將尺寸一致的樣品浸入0.15%的二硫代硫酸鈉溶液中將樣品置于室溫（約20°C）下靜置1-2分鐘，排液后用吸水紙吸干表面，進行真空包裝，隨后在20°C環境中靜置1-2小時以最大限度轉化為DMb。使用與第1、3節檢測肌紅蛋白形態時相同的透氧薄膜重新封裝，并立即進行掃描。研磨后的產物可置于燒杯中的濾網支撐。
b. 氧分壓調控：在樣品內表面制備新鮮切面，確保其脫氧肌紅蛋白含量基本達到100%，并立即進行掃描，通常僅需一次即可完成。由于脫氧肌紅蛋白難以在100%濃度下穩定保留。
c. 或者與步驟2b聯合操作：將樣品置于高阻氧真空袋中進行真空包裝（需使用極高真空度以最大限度減少殘留氧氣），并在4℃環境下保存24至48小時。OMb向DMb的轉化可能較為緩慢，特別是在-1至4℃溫度區間。若將樣品在20℃條件下保持至少50%的時間，可促進OMb向DMb的更完全轉化。通常情況下，由于氧氣分壓較低，OMb會優先轉化為MMb，隨后MMb會逐漸轉化為DMb。若儀器已使用覆蓋瓷磚標準的阻氧膜進行標準化，可直接掃描真空包裝膜以減少OMb生成。但若研究人員希望保持三種肌紅蛋白形態的膜層一致性，則需使用覆蓋標準膜的透氣膜進行標準化。此時應立即從真空包裝中取出樣品，覆蓋透氣膜并馬上進行掃描。
3. 氧合血紅蛋白。
a. 氧氣分壓調控：將先前保存在0至2℃環境中的樣品置于高氧環境中（如炸彈式量熱儀或改良型氣氛包裝袋），用70%至100%的氧氣沖洗后，于0至2℃條件下儲存24至48小時。取出樣品后立即進行掃描。若樣品采用高氧改良氣氛包裝，需確保氣體與肉體積比至少為3：1。對于研磨產品，應采用薄層包裝以促進改良氣氛包裝袋中的氧氣吸收。
b. pH值越高，就越難獲得最大開花（充氧）。
c. 儲存溫度越低，氧與肌紅蛋白的結合就越強，因為酶對氧的競爭越少。
4. 羧基肌紅蛋白。
a. 使用CO時需謹慎。
b. 建議從處于DMb狀態的肉類開始處理，因為CO不太可能與OMb和MMb結合。例如，真空包裝或使用除氧劑的肉類效果更佳，因為微量氧氣就能延緩COMb的形成。
c. 在填充已知濃度的氣體后，應立即對包裝的頂空進行預混處理（使用指定濃度的一氧化碳）或注入計算量的純一氧化碳。隨后將肉品置于改良氣體環境中儲存，該環境含0.4%至1.0%的一氧化碳，余量為氮氣或二氧化碳與氮氣的混合氣體。
d. 在測量表面形成的COMb之前，應將包裝儲存需在4℃條件下持續2至3天，以促進氧氣（及有機物）的去除，并使金屬有機物完全還原為金屬有機化合物，從而確保表面約100%的色素轉化為共價有機物。
c. 通過K/S比值計算肌紅蛋白形式
當肌紅蛋白完全轉化為四種色素形態后，需分別記錄474、525、572和610納米波長下的反射率數據。雖然理想情況下所有掃描應使用同一包裝膜，但實際操作中可能因制備方法不同而無法實現。隨后使用以下公式將反射率百分比轉換為 K/S 值：
K/S =（1−R）（1−R）÷（2R），
其中R表示反射率百分比（需以小數形式呈現）。例如當反射率為30%時，取0.30代入計算，K/S 值應為0.8167。由于多數反射率儀器僅以10納米為間隔記錄數據，因此需通過積分法計算：474納米處使用470和480納米波長積分，525納米處使用520和530納米波長積分，572納米處使用570和580納米波長積分。首先通過積分法計算各波長的反射率值，再將其轉換為 K/S 值。
將這些100%的參考 K/S 值與樣品 K/S 值代入相應公式后，即可計算出樣品表面的脫鎂肌紅蛋白（DMb）、脫鎂肌紅蛋白（OMb）或脫鎂肌紅蛋白（MMb）的百分比。關于肌紅蛋白形態的估算公式，Hunt（1980）曾做過系統總結。文獻中關于脫氧肌紅蛋白和MMb的測定方法屢見不鮮，而脫鎂肌紅蛋白的百分比通常通過100%的差值來確定。不過，由于脫鎂肌紅蛋白含量與消費者偏好密切相關（Hunt），更推薦直接使用610納米波長進行測定（Mancini等，2003），因為該波長對DMb和MMb都具有等比特性。（Kropf，1988）。在計算DMb、OMb和MMb的百分比時，其總和可能不等于100%。若出現這種情況，可參考Mancini等人（2003）提出的處理方法。在許多即食包裝產品中，可通過添加乳酸等多種成分進行改良。由于肉類的反射特性可能受鹽分及其他成分影響（Lamkey等，1986；Swatland和Barbut，1999），因此需要為每種肌紅蛋白形態的100%含量建立參考標準，并進行方程式依賴性計算。為最大限度提高改良產品表面肌紅蛋白氧化還原形態的估算精度，應專門從改良產品中提取100%去甲肌紅蛋白（DMb）、去甲肌紅蛋白（OMb）和肌紅蛋白（MMb）的參考標準（Ramanathan等，2010）。
目前尚無可用于估算肉表面COMb的反射率測量方法。不過，暴露于一氧化碳的牛排光譜特征顯示，COMb在500納米處存在反射峰，且在420納米處呈現Soret吸收峰（Wolfe等人，1978；Ramanathan等人，2010）。金槍魚肌肉的類似結果也已被記錄（Smulevich等人，2007）。Suman等人（2006）發表了純化牛COMb溶液的吸收光譜數據，并得出結論：通過543納米處吸收值與581納米處吸收值的比值，可區分COMb與OMb。此外，100% COMb樣品在503納米處還顯示出明顯的吸收谷。
D. 通過選定波長計算肌紅蛋白形態
克日維茨基（1979年）提出了一種替代 K/S 比值法測定肌紅蛋白形態的新方法。該方法無需完全轉化色素成分，具有顯著優勢。具體操作時，先測定脫氧肌紅蛋白和MMb的含量，再通過100%總含量減去兩者的百分比，間接計算出OMb的含量。該方法基于以下原理：反射衰減(A)是反射率倒數的對數值。反射率在等滲波長474、525和572納米以及730納米處測量，其中730納米的反射率被稱為無色素肉的反射率。部分儀器未在730納米處測量反射率，此時可采用700納米或更接近730納米的波長進行測量。根據公式1將反射率(R)轉換為反射衰減值(A)，并將A值代入公式2計算MMb，代入公式3計算DMb。氧合血紅蛋白的計算采用公式4：
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