DNA(羥)甲基化揭示新型污染物誘導的表觀遺傳變化與癌癥發生相關
近日，浙江大學環境與資源學院趙欣然博士為第一作者、王瑋研究員為通訊作者，在環境領域Top期刊《Environmental Pollution》上發表題為“Genome-wide alterations of DNA methylation and hydroxymethylation in uroepithelial cells revealed potential carcinogenicity of halobenzoquinone disinfection byproducts”的研究成果，探討了鹵代苯醌類新型消毒副產物（Halobenzoquinones, HBQs）對人膀胱上皮細胞的潛在致癌性機制。研究通過結合簡化基因組甲基化測序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS）和羥甲基化測序（Oxidative Reduced Representation Bisulfite Sequencing，oxRRBS）以及對應的轉錄組測序（RNA-seq）聯合分析，系統揭示了HBQs通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式來影響基因表達，進而引發膀胱癌的可能性。該研究不僅為理解HBQs的致癌機制提供了新的視角，還強調了環境因素對基因表達調控的潛在影響。
標題：Genome-wide alterations of DNA methylation and hydroxymethylation in uroepithelial cells revealed potential carcinogenicity of halobenzoquinone disinfection byproducts（DNA甲基化和羥甲基化的全基因組變化揭示了鹵代苯醌類消毒副產物對人膀胱上皮細胞的潛在致癌性）
發表時間：2025年8月16日
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q2
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq
作者單位：浙江大學環境與資源學院
DOI:10.1016/j.envpol.2025.127001
鹵代苯醌（HBQs）是一類廣泛存在于飲用水中的新興消毒副產物（Disinfection Byproducts，DBPs），具有促進5-甲基胞嘧啶（5mC）向5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）轉化的特有功能，被預測為潛在的膀胱致癌物。本研究揭示了人膀胱上皮細胞系SV-HUC-1中胞嘧啶修飾的總體水平，并分析了HBQs誘導的全基因組5mC和5hmC變化。結果顯示，暴露于HBQs后，5hmC總體水平顯著增加，且導致更多的低甲基化位點（39,365個）和高羥甲基化位點（26,053個），其中有7,441個重疊位點，表明5mC有向5hmC轉化的趨勢。與低甲基化差異區域（hypo-DMRs）和高羥甲基化差異區域（hyper-DhMRs）相關的基因在Hippo信號通路、PI3K-AKT信號通路和Wnt信號通路等癌癥相關通路中富集，其中三個與膀胱癌相關基因（CASC8、TTTY14、METRNL）存在顯著差異表達。總之，本研究揭示了HBQs誘導的表觀遺傳變化及其與膀胱癌風險的潛在關聯。
易小結
本研究首次通過多組學技術揭示HBQs通過調控5mC向5hmC的轉化，影響基因表達平衡，為理解其致癌機制提供了表觀遺傳學證據，也為環境因素與癌癥發生之間的關聯提供了新的分子證據，拓展了對消毒副產物健康風險的認知，這對飲用水安全風險評估和DBPs監管政策制定具有重要啟示。
易基因王牌組學產品——RRBS、oxRRBS和RNA-seq等表觀基因組學測序技術展現了其在環境毒理學研究中的強大應用潛力，為未來深入解析環境污染物的表觀遺傳效應、挖掘新的生物標志物和致癌機制提供了重要的技術支撐和研究思路，有助于推動環境健康領域的科學研究邁向更微觀、更精準的新階段。
研究方法
細胞培養與處理：使用人膀胱上皮細胞系SV-HUC-1，將其暴露于不同濃度的HBQs（2,6-DCBQ、2,6-DBBQ和2,6-DIBQ）中72小時。此外，還對細胞進行了不同時間點的處理，以評估時間依賴性效應。提取DNA和RNA。
細胞活力檢測：通過CCK-8實驗評估細胞活力，確定了不同HBQs的半抑制濃度（IC50）。
UPLC-MS/MS分析：利用超高效液相色譜-串聯質譜技術檢測DNA中的胞嘧啶及其修飾形式（5mC、5hmC等）。
RRBS和oxRRBS文庫構建與測序分析：通過RRBS和oxRRBS技術分別檢測全基因組范圍內的5mC和5hmC水平，鑒定差異甲基化位點（DMCs）和差異羥甲基化位點（DhMCs），以及差異甲基化區域（DMRs/DhMRs）。
RNA-seq文庫構建與測序：分析基因表達變化，鑒定差異表達基因（DEGs）以及功能富集分析。
結果圖形
（1）HBQs暴露后細胞5hmC水平升高
研究首先通過CCK-8實驗評估了HBQs對細胞的毒性，確定了不同HBQs的半抑制濃度（IC50）。實驗結果顯示，2,6-DCBQ、2,6-DBBQ和2,6-DIBQ的72小時IC50值分別為285.8±18.4μM、208.1±6.8μM和259.9±7.8μM。基于這些結果，研究選擇1μM、10μM和50μM作為處理濃度，這些濃度下細胞活力均保持在90%以上。接下來，研究利用UPLC-MS/MS技術檢測SV-HUC-1細胞系在HBQs處理后的DNA胞嘧啶及其修飾形式。結果顯示，與對照組相比，HBQs處理組的5hmC水平顯著增加，而5mC水平則未顯著變化。其中，50μM的2,6-DCBQ處理組5hmC水平最高，約為對照組的2.5倍。這一結果表明，HBQs能夠顯著提高細胞的5hmC水平，且這種增加與HBQs的劑量呈正相關。這一發現為后續研究HBQs對DNA甲基化和羥甲基化模式的影響奠定了基礎。
圖1：UPLC-MS/MS檢測經2,6-DCBQ、2,6-DBBQ和2,6-DIBQ處理的SV-HUC-1細胞系中5mC（a）和5hmC（b）水平。
（2）HBQ暴露后5mC和5hmC圖譜變化
為進一步理解HBQs對DNA甲基化和羥甲基化模式的影響，研究采用RRBS和oxRRBS技術對SV-HUC-1細胞系進行測序分析，實現在單堿基分辨率下全基因組范圍的5mC和5hmC圖譜繪制。分析結果顯示，與對照組相比，HBQs處理組的DNA甲基化率在CG、CHG和CHH三種序列環境中均降低，而DNA羥甲基化率則增加。此外研究還發現，HBQs處理組中存在顯著差異甲基化位點（DMCs）和差異羥甲基化位點（DhMCs）。具體而言，共檢測到63,065個DMCs，其中包括23,700個高甲基化位點和39,365個低甲基化位點；同時檢測到49,922個DhMCs，其中包括26,053個高羥甲基化位點和23,869個低羥甲基化位點。其中7,441個低甲基化DMCs與高羥甲基化DhMCs重疊，表明HBQs能夠促進5mC向5hmC轉化。這些結果表明，HBQs能夠顯著改變全基因組范圍內5mC和5hmC分布，進而可能影響基因表達。
圖2：2,6-DCBQ處理組與對照組的DNA甲基化和羥甲基化圖譜。
（a）RRBS分析CG、CHG和CHH序列中的平均甲基化率。
（b）oxRRBS分析CG、CHG和CHH序列中的平均羥甲基化率。
（c）低甲基化位點（hypo-DMCs）和高羥甲基化位點（hyper-DhMCs）維恩圖。
（d）甲基化密度Circos圖。
（e）羥甲基化密度Circos圖。從外到內依次表示：基因數量密度、處理組的甲基化和羥甲基化密度、兩組之間的甲基化和羥甲基化差異、處理組的甲基化和羥甲基化密度。
（3）DMRs、DhMRs及其相關基因的鑒定
在鑒定出DMCs和DhMCs基礎上，研究進一步分析差異甲基化區域（DMRs）和差異羥甲基化區域（DhMRs）。研究共鑒定出7,314個DMRs和5,983個DhMRs，這些DMRs和DhMRs主要分布在基因間區和內含子區，低甲基化DMRs和高羥甲基化DhMRs關聯基因富集在癌癥相關通路（如Hippo信號通路、PI3K-Akt通路和Wnt通路），GO分析表明這些基因參與軸突發育、細胞粘附等生物學過程。KEGG富集進一步驗證PI3K-Akt和Wnt通路在膀胱癌中的關鍵作用。這些結果表明，HBQs通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式，揭示了HBQs對關鍵癌癥通路的表觀遺傳調控。
（b）與高羥甲基化DhMRs相關基因的GO分析。
（c）與低甲基化DMRs相關基因的KEGG通路分析。
（d）與高羥甲基化DhMRs相關基因的KEGG通路分析。
（4）HBQ暴露后轉錄組譜變化
為評估HBQs對基因表達的影響，研究利用RNA-seq技術分析了HBQs處理后SV-HUC-1細胞系的轉錄組變化。主成分分析（PCA）結果顯示，實驗重復一致性良好，而處理組與對照組存在顯著差異。轉錄組分析共鑒定出2,044個差異表達基因（DEGs），其中上調基因1,044個，下調基因1,000個。通過GO富集分析發現這些DEGs主要與IκB激酶（IKK）信號通路、外源物質刺激響應和氧水平響應等生物學過程相關。KEGG富集分析結果表明，DEGs顯著富集在Ras信號通路及其下游通路（如PI3K-Akt和MAPK信號通路），這些通路異常激活與細胞增殖和癌癥發生密切相關。這些結果表明，HBQs暴露能夠顯著改變細胞的轉錄組譜，進而可能影響細胞的正常生理功能和增殖行為。
(b)兩組間差異表達基因(DEGs)的火山圖豐度。
(c)兩組間DEGs的生物過程GO分析。
(d)兩組間DEGs的最富集KEGG通路。
（5）與DMRs/DhMRs相關且表達差異的基因鑒定
研究進一步探討了DMRs和DhMRs與基因表達之間的關系。整合表觀遺傳與轉錄組數據，發現54個啟動子區低甲基化DMRs基因和187個基因體區低甲基化DMRs基因表達差異；30個啟動子區高羥甲基化DhMRs基因和133個基因體區高羥甲基化DhMRs基因表達差異。其中與膀胱癌相關的基因（如CASC8、TTTY14、METRNL）呈現低甲基化或高羥甲基化修飾，且表達顯著改變。此外，Ras通路相關基因（PIK3R3、PAK6等）也受影響。這些結果表明，HBQs暴露能夠通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式來調控與癌癥相關的基因表達，進而可能增加膀胱癌的風險。
結論和啟示
本研究通過結合RRBS、oxRRBS和RNA-seq技術，揭示了鹵代苯醌類消毒副產物（HBQs）對人膀胱上皮細胞的潛在致癌性。研究發現，HBQs能夠顯著提高細胞5hmC水平，并改變全基因組范圍內的5mC和5hmC分布。此外，與DMRs和DhMRs相關的基因在多種生物學過程中發揮重要作用，且這些基因的表達水平在HBQs處理后發生了顯著變化。上述這些結果表明，HBQs可能通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式來調控基因表達，進而增加膀胱癌風險。總之，本研究為理解HBQs的致癌機制提供了重要線索，并強調在飲用水處理過程中關注這類新興消毒副產物的重要性。未來的研究需要在更接近實際環境濃度的條件下進行長期暴露實驗，并結合體內實驗來進一步驗證這些發現。
參考文獻：
Zhao X, Du M, Guo P, Zhao J, Zhu L, Wang W. Genome-wide alterations of DNA methylation and hydroxymethylation in uroepithelial cells revealed potential carcinogenicity of halobenzoquinone disinfection byproducts. Environ Pollut. 2025 Aug 16:127001.doi: 10.1016/j.envpol.2025.127001.
標題：Genome-wide alterations of DNA methylation and hydroxymethylation in uroepithelial cells revealed potential carcinogenicity of halobenzoquinone disinfection byproducts（DNA甲基化和羥甲基化的全基因組變化揭示了鹵代苯醌類消毒副產物對人膀胱上皮細胞的潛在致癌性）
發表時間：2025年8月16日
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q2
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq
作者單位：浙江大學環境與資源學院
DOI:10.1016/j.envpol.2025.127001
鹵代苯醌（HBQs）是一類廣泛存在于飲用水中的新興消毒副產物（Disinfection Byproducts，DBPs），具有促進5-甲基胞嘧啶（5mC）向5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）轉化的特有功能，被預測為潛在的膀胱致癌物。本研究揭示了人膀胱上皮細胞系SV-HUC-1中胞嘧啶修飾的總體水平，并分析了HBQs誘導的全基因組5mC和5hmC變化。結果顯示，暴露于HBQs后，5hmC總體水平顯著增加，且導致更多的低甲基化位點（39,365個）和高羥甲基化位點（26,053個），其中有7,441個重疊位點，表明5mC有向5hmC轉化的趨勢。與低甲基化差異區域（hypo-DMRs）和高羥甲基化差異區域（hyper-DhMRs）相關的基因在Hippo信號通路、PI3K-AKT信號通路和Wnt信號通路等癌癥相關通路中富集，其中三個與膀胱癌相關基因（CASC8、TTTY14、METRNL）存在顯著差異表達。總之，本研究揭示了HBQs誘導的表觀遺傳變化及其與膀胱癌風險的潛在關聯。
圖形摘要
易小結
本研究首次通過多組學技術揭示HBQs通過調控5mC向5hmC的轉化，影響基因表達平衡，為理解其致癌機制提供了表觀遺傳學證據，也為環境因素與癌癥發生之間的關聯提供了新的分子證據，拓展了對消毒副產物健康風險的認知，這對飲用水安全風險評估和DBPs監管政策制定具有重要啟示。
易基因王牌組學產品——RRBS、oxRRBS和RNA-seq等表觀基因組學測序技術展現了其在環境毒理學研究中的強大應用潛力，為未來深入解析環境污染物的表觀遺傳效應、挖掘新的生物標志物和致癌機制提供了重要的技術支撐和研究思路，有助于推動環境健康領域的科學研究邁向更微觀、更精準的新階段。
研究方法
細胞培養與處理：使用人膀胱上皮細胞系SV-HUC-1，將其暴露于不同濃度的HBQs（2,6-DCBQ、2,6-DBBQ和2,6-DIBQ）中72小時。此外，還對細胞進行了不同時間點的處理，以評估時間依賴性效應。提取DNA和RNA。
細胞活力檢測：通過CCK-8實驗評估細胞活力，確定了不同HBQs的半抑制濃度（IC50）。
UPLC-MS/MS分析：利用超高效液相色譜-串聯質譜技術檢測DNA中的胞嘧啶及其修飾形式（5mC、5hmC等）。
RRBS和oxRRBS文庫構建與測序分析：通過RRBS和oxRRBS技術分別檢測全基因組范圍內的5mC和5hmC水平，鑒定差異甲基化位點（DMCs）和差異羥甲基化位點（DhMCs），以及差異甲基化區域（DMRs/DhMRs）。
RNA-seq文庫構建與測序：分析基因表達變化，鑒定差異表達基因（DEGs）以及功能富集分析。
結果圖形
（1）HBQs暴露后細胞5hmC水平升高
研究首先通過CCK-8實驗評估了HBQs對細胞的毒性，確定了不同HBQs的半抑制濃度（IC50）。實驗結果顯示，2,6-DCBQ、2,6-DBBQ和2,6-DIBQ的72小時IC50值分別為285.8±18.4μM、208.1±6.8μM和259.9±7.8μM。基于這些結果，研究選擇1μM、10μM和50μM作為處理濃度，這些濃度下細胞活力均保持在90%以上。接下來，研究利用UPLC-MS/MS技術檢測SV-HUC-1細胞系在HBQs處理后的DNA胞嘧啶及其修飾形式。結果顯示，與對照組相比，HBQs處理組的5hmC水平顯著增加，而5mC水平則未顯著變化。其中，50μM的2,6-DCBQ處理組5hmC水平最高，約為對照組的2.5倍。這一結果表明，HBQs能夠顯著提高細胞的5hmC水平，且這種增加與HBQs的劑量呈正相關。這一發現為后續研究HBQs對DNA甲基化和羥甲基化模式的影響奠定了基礎。
（2）HBQ暴露后5mC和5hmC圖譜變化
為進一步理解HBQs對DNA甲基化和羥甲基化模式的影響，研究采用RRBS和oxRRBS技術對SV-HUC-1細胞系進行測序分析，實現在單堿基分辨率下全基因組范圍的5mC和5hmC圖譜繪制。分析結果顯示，與對照組相比，HBQs處理組的DNA甲基化率在CG、CHG和CHH三種序列環境中均降低，而DNA羥甲基化率則增加。此外研究還發現，HBQs處理組中存在顯著差異甲基化位點（DMCs）和差異羥甲基化位點（DhMCs）。具體而言，共檢測到63,065個DMCs，其中包括23,700個高甲基化位點和39,365個低甲基化位點；同時檢測到49,922個DhMCs，其中包括26,053個高羥甲基化位點和23,869個低羥甲基化位點。其中7,441個低甲基化DMCs與高羥甲基化DhMCs重疊，表明HBQs能夠促進5mC向5hmC轉化。這些結果表明，HBQs能夠顯著改變全基因組范圍內5mC和5hmC分布，進而可能影響基因表達。
圖2：2,6-DCBQ處理組與對照組的DNA甲基化和羥甲基化圖譜。
（b）oxRRBS分析CG、CHG和CHH序列中的平均羥甲基化率。
（c）低甲基化位點（hypo-DMCs）和高羥甲基化位點（hyper-DhMCs）維恩圖。
（d）甲基化密度Circos圖。
（e）羥甲基化密度Circos圖。從外到內依次表示：基因數量密度、處理組的甲基化和羥甲基化密度、兩組之間的甲基化和羥甲基化差異、處理組的甲基化和羥甲基化密度。
（3）DMRs、DhMRs及其相關基因的鑒定
在鑒定出DMCs和DhMCs基礎上，研究進一步分析差異甲基化區域（DMRs）和差異羥甲基化區域（DhMRs）。研究共鑒定出7,314個DMRs和5,983個DhMRs，這些DMRs和DhMRs主要分布在基因間區和內含子區，低甲基化DMRs和高羥甲基化DhMRs關聯基因富集在癌癥相關通路（如Hippo信號通路、PI3K-Akt通路和Wnt通路），GO分析表明這些基因參與軸突發育、細胞粘附等生物學過程。KEGG富集進一步驗證PI3K-Akt和Wnt通路在膀胱癌中的關鍵作用。這些結果表明，HBQs通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式，揭示了HBQs對關鍵癌癥通路的表觀遺傳調控。
圖3：DMRs（a）和DhMRs（b）的基因組注釋。
圖4：DMRs和DhMRs相關基因的GO和KEGG通路分析。
（a）與低甲基化DMRs相關基因的GO分析。（b）與高羥甲基化DhMRs相關基因的GO分析。
（c）與低甲基化DMRs相關基因的KEGG通路分析。
（d）與高羥甲基化DhMRs相關基因的KEGG通路分析。
（4）HBQ暴露后轉錄組譜變化
為評估HBQs對基因表達的影響，研究利用RNA-seq技術分析了HBQs處理后SV-HUC-1細胞系的轉錄組變化。主成分分析（PCA）結果顯示，實驗重復一致性良好，而處理組與對照組存在顯著差異。轉錄組分析共鑒定出2,044個差異表達基因（DEGs），其中上調基因1,044個，下調基因1,000個。通過GO富集分析發現這些DEGs主要與IκB激酶（IKK）信號通路、外源物質刺激響應和氧水平響應等生物學過程相關。KEGG富集分析結果表明，DEGs顯著富集在Ras信號通路及其下游通路（如PI3K-Akt和MAPK信號通路），這些通路異常激活與細胞增殖和癌癥發生密切相關。這些結果表明，HBQs暴露能夠顯著改變細胞的轉錄組譜，進而可能影響細胞的正常生理功能和增殖行為。
圖5：2,6-DCBQ暴露導致SV-HUC-1細胞系的轉錄組譜發生變化。
(a)2,6-DCBQ處理組和對照組的主成分分析（PCA）。(b)兩組間差異表達基因(DEGs)的火山圖豐度。
(c)兩組間DEGs的生物過程GO分析。
(d)兩組間DEGs的最富集KEGG通路。
（5）與DMRs/DhMRs相關且表達差異的基因鑒定
研究進一步探討了DMRs和DhMRs與基因表達之間的關系。整合表觀遺傳與轉錄組數據，發現54個啟動子區低甲基化DMRs基因和187個基因體區低甲基化DMRs基因表達差異；30個啟動子區高羥甲基化DhMRs基因和133個基因體區高羥甲基化DhMRs基因表達差異。其中與膀胱癌相關的基因（如CASC8、TTTY14、METRNL）呈現低甲基化或高羥甲基化修飾，且表達顯著改變。此外，Ras通路相關基因（PIK3R3、PAK6等）也受影響。這些結果表明，HBQs暴露能夠通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式來調控與癌癥相關的基因表達，進而可能增加膀胱癌的風險。
圖6：DMRs/DhMRs和DEGs在啟動子（a）及基因體（b）中的重疊基因。
結論和啟示
本研究通過結合RRBS、oxRRBS和RNA-seq技術，揭示了鹵代苯醌類消毒副產物（HBQs）對人膀胱上皮細胞的潛在致癌性。研究發現，HBQs能夠顯著提高細胞5hmC水平，并改變全基因組范圍內的5mC和5hmC分布。此外，與DMRs和DhMRs相關的基因在多種生物學過程中發揮重要作用，且這些基因的表達水平在HBQs處理后發生了顯著變化。上述這些結果表明，HBQs可能通過改變DNA甲基化和羥甲基化模式來調控基因表達，進而增加膀胱癌風險。總之，本研究為理解HBQs的致癌機制提供了重要線索，并強調在飲用水處理過程中關注這類新興消毒副產物的重要性。未來的研究需要在更接近實際環境濃度的條件下進行長期暴露實驗，并結合體內實驗來進一步驗證這些發現。
參考文獻：
Zhao X, Du M, Guo P, Zhao J, Zhu L, Wang W. Genome-wide alterations of DNA methylation and hydroxymethylation in uroepithelial cells revealed potential carcinogenicity of halobenzoquinone disinfection byproducts. Environ Pollut. 2025 Aug 16:127001.doi: 10.1016/j.envpol.2025.127001.
標簽：
DNA甲基化
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