對不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄組展開深入分析，篩選出多個在不同組織區(qū)域間表達(dá)差異顯著的基因，推測這些基因可能是早期 CRC 的理想生物標(biāo)志物。下一步通過 IHC 驗證這些差異基因的表達(dá)變化是否與蛋白質(zhì)豐度變化相符，以確認(rèn)所選候選生物標(biāo)志物（差異蛋白）可作為臨床生物標(biāo)志物。
（2）CRC 腫瘤發(fā)生過程中上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞富集不同生物學(xué)過程
利用 Wiki Pathways database 進行富集分析，篩選出 7 個與不同程度惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的通路簇（C1-C7）。上皮細(xì)胞以富集 C1、C2、C4 中的通路為主，涉及增殖、DNA 損傷修復(fù)及代謝等生物學(xué)過程；C3 中的通路在上下皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞中均富集，與腫瘤進展具有相關(guān)性；基質(zhì)細(xì)胞主要富集 C5、C6、C7 中的通路，關(guān)聯(lián)免疫抑制等惡性腫瘤發(fā)展生物學(xué)過程。說明腫瘤發(fā)生存在顯著轉(zhuǎn)錄組改變，且有惡性腫瘤相關(guān)生物學(xué)過程，這些過程特異性富集于腫瘤上皮或基質(zhì)細(xì)胞。
（3）結(jié)直腸癌進展過程中的免疫變化，與 CD47-SIRPα 軸信號上調(diào)有關(guān)
經(jīng)富集分析篩選出大量免疫相關(guān)通路，接下來重點分析不同組織學(xué)區(qū)域間腫瘤（免疫）微環(huán)境的差異。利用免疫細(xì)胞反卷積算法計算各 ROI 內(nèi)特定細(xì)胞亞群的相對豐度，結(jié)果表明從正常組織到癌組織，免疫細(xì)胞相對豐度呈下降趨勢，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的相對豐度則升高。為更全面表征免疫微環(huán)境，進一步實施 WikiPathways 通路富集分析與差異基因分析，發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化早期存在炎癥反應(yīng)，CRC 發(fā)生時先天免疫反應(yīng)被激活；同時，CD276（B7-H3）和 SIRPA（SIRPα）在高級別增生區(qū)域與癌區(qū)域的基質(zhì)中表達(dá)增加。
接下來借助 IHC 對差異基因 CD276、SIRPA 進行蛋白層面驗證，結(jié)果顯示從正常結(jié)直腸組織到癌組織，CD47 和 SIRPα 的表達(dá)呈逐步上升趨勢，說明結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與 CD47-SIRPα 軸信號上調(diào)有關(guān)。
（4）巨噬細(xì)胞亞型在從正常組織到癌癥的進展過程發(fā)生轉(zhuǎn)變
為更精準(zhǔn)表征免疫微環(huán)境的改變，運用成像質(zhì)譜流式（IMC）技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)從正常結(jié)直腸組織到癌組織，特定巨噬細(xì)胞群（CD68、CD163、HLA-DR、CD204）的相對豐度有顯著變化。為明確巨噬細(xì)胞亞型，研究者采用前人已發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集開展分析，結(jié)果顯示從正常結(jié)腸組織到發(fā)育異常再到腫瘤轉(zhuǎn)變過程中，髓系細(xì)胞浸潤增多，巨噬細(xì)胞發(fā)生從促炎癥性 HLA-DR+ CD204 + 亞型向 HLA-DR-CD204 + 免疫抑制亞型的轉(zhuǎn)變。
3、結(jié)論
該研究聯(lián)合 DSP 空間組學(xué)、IMC 和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析技術(shù)，從空間生物學(xué)角度深入剖析 CRC 惡性轉(zhuǎn)化過程中的轉(zhuǎn)錄組與免疫學(xué)變化，不僅揭示了 CRC 發(fā)病和進展的生物學(xué)機制，還確定了與疾病進展密切關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物，以及有望應(yīng)用于臨床免疫治療的潛在靶標(biāo) CD47-SIRPα。
樂備實是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學(xué)分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴展到單細(xì)胞測序、空間多組學(xué)、流式檢測、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
