高通量RNA測(cè)序（RNA-seq）的基礎(chǔ)原理與技術(shù)參數(shù)
高通量 RNA 測(cè)序（RNA-seq）
1. 核心基礎(chǔ)概念
1.1 轉(zhuǎn)錄組
轉(zhuǎn)錄組是指在特定生理或?qū)嶒?yàn)條件下，單個(gè)細(xì)胞、組織或個(gè)體產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合。廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA；狹義轉(zhuǎn)錄組特指所有 mRNA 的集合，在未額外說(shuō)明的實(shí)際研究中，轉(zhuǎn)錄組通常默認(rèn)指代 mRNA。轉(zhuǎn)錄組可反映樣本的整體基因表達(dá)水平，因此也被稱為表達(dá)譜，常用基因芯片和 RNA-seq 技術(shù)開(kāi)展研究。
Q1：廣義轉(zhuǎn)錄組與狹義轉(zhuǎn)錄組的核心區(qū)別是什么？
A1：核心區(qū)別在于包含的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物范圍，廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA，狹義轉(zhuǎn)錄組僅包含 mRNA，實(shí)際研究中默認(rèn)指代狹義轉(zhuǎn)錄組。
Q2：研究轉(zhuǎn)錄組的主要技術(shù)手段有哪些？
A2：主要技術(shù)手段包括基因芯片技術(shù)和 RNA-seq 技術(shù)，其中 RNA-seq 作為高通量測(cè)序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)和基因表達(dá)分析中應(yīng)用廣泛。
1.2 轉(zhuǎn)錄本
所有從基因轉(zhuǎn)錄生成的 RNA 分子均稱為轉(zhuǎn)錄本。不同細(xì)胞（如肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）雖含相同 DNA 序列，但因開(kāi)放表達(dá)的基因不同，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本及后續(xù)蛋白質(zhì)存在差異。轉(zhuǎn)錄本分為兩類：一類是可被核糖體翻譯為蛋白質(zhì)的 mRNA；另一類是無(wú)法翻譯為蛋白質(zhì)、自身具備功能的非編碼 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：轉(zhuǎn)錄本的分類依據(jù)是什么？
A1：分類依據(jù)是能否被翻譯為蛋白質(zhì)，可翻譯為蛋白質(zhì)的是 mRNA，無(wú)法翻譯且自身有功能的是非編碼 RNA（ncRNA）。
Q2：不同細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄本存在差異的原因是什么？
A2：原因是不同細(xì)胞中開(kāi)放表達(dá)的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表達(dá)的選擇性導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本種類和數(shù)量存在差異。
1.3 轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生過(guò)程
轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生以 DNA 為模板，具體過(guò)程分為兩步：
DNA 中的基因片段先轉(zhuǎn)錄生成 pre-mRNA，該階段生成的 pre-mRNA 包含未翻譯區(qū)域（UTRs）、開(kāi)放閱讀框（ORF）及內(nèi)含子序列；
轉(zhuǎn)錄后加工階段，pre-mRNA 中的內(nèi)含子被去除，同時(shí)在 RNA 的 5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最終形成可翻譯為蛋白質(zhì)的成熟 mRNA 轉(zhuǎn)錄本。
其中，mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾具有保護(hù) RNA 免受核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾、參與核轉(zhuǎn)運(yùn)、影響 RNA 穩(wěn)定性及翻譯效率等功能；非編碼 RNA 通常不具備這兩種結(jié)構(gòu)。
Q1：pre-mRNA 加工為成熟 mRNA 的關(guān)鍵步驟是什么？
A1：關(guān)鍵步驟包括內(nèi)含子去除、5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加 polyA 尾，這三個(gè)步驟共同保障 mRNA 的功能和穩(wěn)定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保護(hù) mRNA 不被核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾與核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、維持 mRNA 穩(wěn)定性及調(diào)控翻譯效率，對(duì) mRNA 的生物學(xué)功能至關(guān)重要。
2. RNA-seq 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)
2.1 測(cè)序深度（Sequencing depth）
測(cè)序深度又稱 “乘數(shù)”，是指測(cè)序過(guò)程中樣本中每個(gè)堿基被檢測(cè)到的平均次數(shù)，是衡量測(cè)序數(shù)據(jù)量的核心參數(shù)，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每個(gè)堿基被測(cè)序 100 次）。其計(jì)算邏輯為測(cè)序獲得的總有效數(shù)據(jù)量與目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）大小的比值。
Q1：測(cè)序深度的單位 “X” 代表什么含義？
A1：“X” 代表樣本中每個(gè)堿基被測(cè)序的平均次數(shù)，例如 50X 即表示平均每個(gè)堿基在測(cè)序中被檢測(cè)到 50 次。
Q2：計(jì)算測(cè)序深度時(shí)，分子和分母分別對(duì)應(yīng)什么數(shù)據(jù)？
A2：分子是測(cè)序獲得的總有效數(shù)據(jù)量，分母是目標(biāo)研究對(duì)象（如基因組或轉(zhuǎn)錄組）的總大小，兩者的比值即為測(cè)序深度。
2.2 測(cè)序覆蓋度（Coverage）
測(cè)序覆蓋度又稱 “覆蓋率”，是指測(cè)序過(guò)程中被檢測(cè)到的堿基數(shù)量占目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）總堿基數(shù)量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，對(duì)人類基因組（大小約 3G）測(cè)序后，若有 2.7G 堿基至少被 1 條讀段覆蓋，則測(cè)序覆蓋度為 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：測(cè)序覆蓋度與測(cè)序深度的核心區(qū)別是什么？
A1：測(cè)序覆蓋度反映 “被檢測(cè)到的堿基范圍占比”，用百分比表示；測(cè)序深度反映 “每個(gè)堿基被檢測(cè)的平均次數(shù)”，用 “X” 表示，兩者分別從 “范圍” 和 “次數(shù)” 描述測(cè)序效果。
Q2：若目標(biāo)基因組大小為 2G，測(cè)序后有 1.8G 堿基被覆蓋，其測(cè)序覆蓋度是多少？
A2：測(cè)序覆蓋度為 90%，計(jì)算方式為被覆蓋的堿基量（1.8G）除以目標(biāo)基因組大小（2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 測(cè)序的直接結(jié)果，指測(cè)序過(guò)程中儀器檢測(cè)到的單條 RNA 序列片段，1 條獨(dú)立的序列片段即稱為 1 條 reads。這些 reads 需后續(xù)通過(guò)比對(duì)軟件與參考基因組（或轉(zhuǎn)錄組）進(jìn)行匹配，才能用于基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，通過(guò)與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，可進(jìn)一步分析基因表達(dá)水平、識(shí)別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本。
Q2：1 條 reads 是否等同于 1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本？
A2：不等同。1 條 reads 是轉(zhuǎn)錄本的片段序列，1 個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本通常需要多條 reads 通過(guò)拼接或比對(duì)后才能完整呈現(xiàn)。
2.4 adapter（接頭序列）
adapter 是 RNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能。其核心作用是協(xié)助測(cè)序儀器識(shí)別并結(jié)合 RNA 片段，保障測(cè)序反應(yīng)的順利啟動(dòng)，測(cè)序完成后需通過(guò)生物信息學(xué)分析去除 adapter 序列，避免其對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)解讀產(chǎn)生干擾。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是協(xié)助測(cè)序儀器識(shí)別和結(jié)合 RNA 片段，為測(cè)序反應(yīng)的啟動(dòng)提供必要條件，是文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序過(guò)程中的關(guān)鍵輔助序列。
Q2：測(cè)序完成后為何需要去除 adapter 序列？
A2：因?yàn)?adapter 是人工添加的輔助序列，并非樣本自身的 RNA 片段，若不去除會(huì)干擾基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本比對(duì)等后續(xù)分析，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。
RNA-seq 核心概念與技術(shù)參數(shù)對(duì)照表
3. 總結(jié)
RNA-seq 作為高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組中的 RNA 分子，可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)水平分析、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)及轉(zhuǎn)錄后修飾研究。理解轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄本等基礎(chǔ)概念，掌握測(cè)序深度、覆蓋度、reads、adapter 等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，是開(kāi)展 RNA-seq 研究及解讀數(shù)據(jù)結(jié)果的核心前提，為后續(xù)基因功能解析、生物過(guò)程調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)支撐。
1. 核心基礎(chǔ)概念
1.1 轉(zhuǎn)錄組
轉(zhuǎn)錄組是指在特定生理或?qū)嶒?yàn)條件下，單個(gè)細(xì)胞、組織或個(gè)體產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合。廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA；狹義轉(zhuǎn)錄組特指所有 mRNA 的集合，在未額外說(shuō)明的實(shí)際研究中，轉(zhuǎn)錄組通常默認(rèn)指代 mRNA。轉(zhuǎn)錄組可反映樣本的整體基因表達(dá)水平，因此也被稱為表達(dá)譜，常用基因芯片和 RNA-seq 技術(shù)開(kāi)展研究。
Q1：廣義轉(zhuǎn)錄組與狹義轉(zhuǎn)錄組的核心區(qū)別是什么？
A1：核心區(qū)別在于包含的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物范圍，廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA，狹義轉(zhuǎn)錄組僅包含 mRNA，實(shí)際研究中默認(rèn)指代狹義轉(zhuǎn)錄組。
Q2：研究轉(zhuǎn)錄組的主要技術(shù)手段有哪些？
A2：主要技術(shù)手段包括基因芯片技術(shù)和 RNA-seq 技術(shù)，其中 RNA-seq 作為高通量測(cè)序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)和基因表達(dá)分析中應(yīng)用廣泛。
1.2 轉(zhuǎn)錄本
所有從基因轉(zhuǎn)錄生成的 RNA 分子均稱為轉(zhuǎn)錄本。不同細(xì)胞（如肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）雖含相同 DNA 序列，但因開(kāi)放表達(dá)的基因不同，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本及后續(xù)蛋白質(zhì)存在差異。轉(zhuǎn)錄本分為兩類：一類是可被核糖體翻譯為蛋白質(zhì)的 mRNA；另一類是無(wú)法翻譯為蛋白質(zhì)、自身具備功能的非編碼 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：轉(zhuǎn)錄本的分類依據(jù)是什么？
A1：分類依據(jù)是能否被翻譯為蛋白質(zhì)，可翻譯為蛋白質(zhì)的是 mRNA，無(wú)法翻譯且自身有功能的是非編碼 RNA（ncRNA）。
Q2：不同細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄本存在差異的原因是什么？
A2：原因是不同細(xì)胞中開(kāi)放表達(dá)的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表達(dá)的選擇性導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本種類和數(shù)量存在差異。
1.3 轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生過(guò)程
轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生以 DNA 為模板，具體過(guò)程分為兩步：
DNA 中的基因片段先轉(zhuǎn)錄生成 pre-mRNA，該階段生成的 pre-mRNA 包含未翻譯區(qū)域（UTRs）、開(kāi)放閱讀框（ORF）及內(nèi)含子序列；
轉(zhuǎn)錄后加工階段，pre-mRNA 中的內(nèi)含子被去除，同時(shí)在 RNA 的 5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最終形成可翻譯為蛋白質(zhì)的成熟 mRNA 轉(zhuǎn)錄本。
其中，mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾具有保護(hù) RNA 免受核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾、參與核轉(zhuǎn)運(yùn)、影響 RNA 穩(wěn)定性及翻譯效率等功能；非編碼 RNA 通常不具備這兩種結(jié)構(gòu)。
Q1：pre-mRNA 加工為成熟 mRNA 的關(guān)鍵步驟是什么？
A1：關(guān)鍵步驟包括內(nèi)含子去除、5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加 polyA 尾，這三個(gè)步驟共同保障 mRNA 的功能和穩(wěn)定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保護(hù) mRNA 不被核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾與核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、維持 mRNA 穩(wěn)定性及調(diào)控翻譯效率，對(duì) mRNA 的生物學(xué)功能至關(guān)重要。
2. RNA-seq 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)
2.1 測(cè)序深度（Sequencing depth）
測(cè)序深度又稱 “乘數(shù)”，是指測(cè)序過(guò)程中樣本中每個(gè)堿基被檢測(cè)到的平均次數(shù)，是衡量測(cè)序數(shù)據(jù)量的核心參數(shù)，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每個(gè)堿基被測(cè)序 100 次）。其計(jì)算邏輯為測(cè)序獲得的總有效數(shù)據(jù)量與目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）大小的比值。
Q1：測(cè)序深度的單位 “X” 代表什么含義？
A1：“X” 代表樣本中每個(gè)堿基被測(cè)序的平均次數(shù)，例如 50X 即表示平均每個(gè)堿基在測(cè)序中被檢測(cè)到 50 次。
Q2：計(jì)算測(cè)序深度時(shí)，分子和分母分別對(duì)應(yīng)什么數(shù)據(jù)？
A2：分子是測(cè)序獲得的總有效數(shù)據(jù)量，分母是目標(biāo)研究對(duì)象（如基因組或轉(zhuǎn)錄組）的總大小，兩者的比值即為測(cè)序深度。
2.2 測(cè)序覆蓋度（Coverage）
測(cè)序覆蓋度又稱 “覆蓋率”，是指測(cè)序過(guò)程中被檢測(cè)到的堿基數(shù)量占目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）總堿基數(shù)量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，對(duì)人類基因組（大小約 3G）測(cè)序后，若有 2.7G 堿基至少被 1 條讀段覆蓋，則測(cè)序覆蓋度為 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：測(cè)序覆蓋度與測(cè)序深度的核心區(qū)別是什么？
A1：測(cè)序覆蓋度反映 “被檢測(cè)到的堿基范圍占比”，用百分比表示；測(cè)序深度反映 “每個(gè)堿基被檢測(cè)的平均次數(shù)”，用 “X” 表示，兩者分別從 “范圍” 和 “次數(shù)” 描述測(cè)序效果。
Q2：若目標(biāo)基因組大小為 2G，測(cè)序后有 1.8G 堿基被覆蓋，其測(cè)序覆蓋度是多少？
A2：測(cè)序覆蓋度為 90%，計(jì)算方式為被覆蓋的堿基量（1.8G）除以目標(biāo)基因組大小（2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 測(cè)序的直接結(jié)果，指測(cè)序過(guò)程中儀器檢測(cè)到的單條 RNA 序列片段，1 條獨(dú)立的序列片段即稱為 1 條 reads。這些 reads 需后續(xù)通過(guò)比對(duì)軟件與參考基因組（或轉(zhuǎn)錄組）進(jìn)行匹配，才能用于基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，通過(guò)與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，可進(jìn)一步分析基因表達(dá)水平、識(shí)別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本。
Q2：1 條 reads 是否等同于 1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本？
A2：不等同。1 條 reads 是轉(zhuǎn)錄本的片段序列，1 個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本通常需要多條 reads 通過(guò)拼接或比對(duì)后才能完整呈現(xiàn)。
2.4 adapter（接頭序列）
adapter 是 RNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能。其核心作用是協(xié)助測(cè)序儀器識(shí)別并結(jié)合 RNA 片段，保障測(cè)序反應(yīng)的順利啟動(dòng)，測(cè)序完成后需通過(guò)生物信息學(xué)分析去除 adapter 序列，避免其對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)解讀產(chǎn)生干擾。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是協(xié)助測(cè)序儀器識(shí)別和結(jié)合 RNA 片段，為測(cè)序反應(yīng)的啟動(dòng)提供必要條件，是文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序過(guò)程中的關(guān)鍵輔助序列。
Q2：測(cè)序完成后為何需要去除 adapter 序列？
A2：因?yàn)?adapter 是人工添加的輔助序列，并非樣本自身的 RNA 片段，若不去除會(huì)干擾基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本比對(duì)等后續(xù)分析，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。
RNA-seq 核心概念與技術(shù)參數(shù)對(duì)照表
3. 總結(jié)
RNA-seq 作為高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組中的 RNA 分子，可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)水平分析、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)及轉(zhuǎn)錄后修飾研究。理解轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄本等基礎(chǔ)概念，掌握測(cè)序深度、覆蓋度、reads、adapter 等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，是開(kāi)展 RNA-seq 研究及解讀數(shù)據(jù)結(jié)果的核心前提，為后續(xù)基因功能解析、生物過(guò)程調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)支撐。
| 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
| 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)實(shí)驗(yàn)服務(wù) | LX-RNAseq | / |
| 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）檢測(cè)試劑盒 | LXR-RNAseq | / |
| NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v3 | NOVA-5132-05 | 8rxns |
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