靶向CD177+中性粒細胞的線粒體復合物I可緩解肺缺血再灌注損傷的研究

期刊：Cell reports. Medicine
影響因子：10.6
主要技術：scRNA-seq、Stereo-seq

導語
原發性移植物功能障礙（PGD）是肺移植后早期發病率和死亡率的主要原因，中性粒細胞在其炎癥病理中起著核心作用。文章利用scRNA-seq和Stereo-seq等技術，研究肺缺血再灌注損傷（IRI）模型中的中性粒細胞亞型。研究發現CD177+中性粒細胞是一個活化的亞群，顯著促進了肺損傷，并作為預測人類肺移植受者中重度PGD的早期生物標志物。CD177+中性粒細胞表現出增強的氧化磷酸化和增加的線粒體復合體I活性，推動炎癥反應和中性粒細胞外陷阱的形成。通過使用復合體I抑制劑IACS-010759靶向線粒體功能，可以減少CD177+中性粒細胞的活化，并在小鼠IRI模型和大鼠左肺移植模型中減輕肺損傷。這些發現為CD177+中性粒細胞驅動的肺IRI炎癥提供了全面的圖景，并強調了其在未來早期診斷和治療干預中的潛在價值。

主要技術
scRNA-seq、Stereo-seq

研究結果
1. IRI小鼠肺組織的免疫學特征為顯著的Cd177+中性粒細胞浸潤
對10個左肺組織（6個IRI與4個假手術）進行scRNA-seq測序，保留了43,852個免疫細胞轉錄組用于后續分析（圖1B）。進行聚類和注釋得到CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、自然殺傷（NK）細胞、B細胞和髓系細胞，發現髓系細胞中差異表達基因（DEGs）的數量大大超過了其他免疫細胞群體中的數量，表明在肺IRI期間存在強大的先天免疫激活（圖1C）。對比IRI組和假手術對照組的髓系細胞，發現參與急性白細胞反應的巨噬細胞和單核細胞高表達Stat3、S100a8、S100a9等，并在IRI組中遷移至受損肺部（圖1D）。進一步研究發現，中性粒細胞是在再灌注后最被激活的細胞類型（圖1E）。因此，將分析重點放在小鼠scRNA-seq數據中被鑒定為肺相關中性粒細胞（LAN）的2973個細胞上（圖1F）。所有LAN細胞的基因表達模式劃分出5種轉錄上不同的狀態（圖1G-H）。其中，LAN3在IRI組中顯著增加（圖1I），差異表達基因（DEGs）和GO富集分析顯示LAN3參與超氧陰離子生成和細胞殺傷（圖1J）。另外，LAN3顯示出最高的顆粒評分,特異性表達與炎癥相關的基因Cd177。綜上所述，這些發現表明CD177可能參與了肺IRI期間中性粒細胞的激活過程。

圖 1

2. Cd177+中性粒細胞的激活是缺血再灌注誘導的肺損傷的主要原因
為闡明Cd177+中性粒細胞的作用，采用Stereo-seq技術來驗證scRNA-seq。利用分水嶺算法對核酸染色圖像進行單細胞分割，得到了細胞的空間分布（圖2A）。接著，在免疫細胞浸潤區域發現Cd177轉錄本水平升高，并且特定顆粒基因（Ltf）和模式識別蛋白（Pglyrp1）的表達也有所增加（圖2B-C）。進一步分析了Cd177+和Cd177−中性粒細胞，與scRNA-seq中的LAN3一致，Cd177+中性粒細胞與急性反應以及白細胞介素1和腫瘤壞死因子α產生相關的轉錄本富集，并且在受損的IRI肺部區域，瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）、CD177和Ly6G共定位，表明Cd177+中性粒細胞是一個功能上被激活的群體（圖2D-E）。為了系統地研究CD177+中性粒細胞的影響，研究人員生成了Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠，這種小鼠的中性粒細胞中特異性地缺失了Cd177基因。體外實驗顯示，人類和小鼠的CD177缺失中性粒細胞均表現出活性氧（ROS）產生的減少，并且在形成中性粒細胞外陷阱（NET）方面效率較低，表現為雙鏈DNA（dsDNA）產生量減少（圖2F-G）。在肺門阻斷肺IRI模型中，Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠的左肺顯示出最小的損傷，保持了結構完整性，且缺乏肺泡水腫或透明膜形成，NETs的浸潤幾乎不存在（圖2H-I）。這些結果表明，Cd177+中性粒細胞在肺IRI發病機制中起重要作用，而Cd177基因缺失可以有效減輕肺損傷并保留功能。

圖 2

3. 外周血CD177+細胞作為重度PGD的早期預測因子
為探究IRI小鼠肺部Cd177+中性粒細胞的來源，對來自血液的存活中性粒細胞（IRI組與假手術組，各3份）進行了scRNA-seq測序。得到PBN1-4四個亞群，其中PBN3在IRI組顯著富集，表現為低表達成熟標記物Cxcr4、Sell、高表達Mmp8、Sa1008、Camp等的Cd177+中性粒細胞，與LAN3群體一致（圖3A-C）。通過骨髓親和性評分、CytoTrace和Monocle3分析，發現PBN3和LAN3處于最少分化的狀態，表明Cd177+中性粒細胞是一種未成熟的激活細胞，可能在IRI期間從骨髓迅速釋放并被招募至肺部（圖3D-F）。

此外，研究人員評估了104名肺移植受者（LTRs）在移植前和移植后4小時的血液樣本，其中25人在移植后72小時內發展為3級PGD。通過流式細胞術分析外周血中的CD177+中性粒細胞，發現移植后4小時內CD177+中性粒細胞比例的變化（ΔCD177+中性粒細胞）可作為3級PGD的早期診斷指標。與傳統的中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）相比，ΔCD177+中性粒細胞在3級PGD組中顯著更高（圖3G-H），且具有更高的預測能力，邏輯回歸分析顯示其比值比為1.813，特征曲線分析也表明其具有出色的預測能力（AUC = 0.871）（圖3I）。

圖 3

4. CD177+中性粒細胞表現出增加的復合體I形成和線粒體活性
研究人員利用單細胞代謝組學技術(scMetabolism）評估小鼠中性粒細胞的代謝途徑活性，發現LAN3群體在氧化磷酸化（OXPHOS）和碳水化合物代謝方面顯著富集，表明線粒體OXPHOS是Cd177+中性粒細胞激活的基礎（圖4A-B）。蛋白質組學分析顯示，人類和小鼠的CD177+中性粒細胞中多種蛋白質表達升高，特別是與OXPHOS相關的通路（圖4C-D）。人類CD177+細胞中線粒體復合體I的核心亞基NDUFA11和NDUFS1水平顯著增加（圖4E）。透射電子顯微鏡和熒光染色揭示，CD177−細胞的線粒體嵴腔更窄，活性氧減少，而CD177+細胞的氧氣消耗率（OCR）更高（圖4F-4G）。PAGE和免疫印跡分析進一步證實了CD177+細胞中NDUFS1表達的顯著增加（圖4H）。共聚焦顯微鏡觀察到，CD177與整合素αMβ2（MAC-1和CD11b/CD18）相互作用可增加線粒體活性氧（圖4I）。分析CD11b相互作用組發現，ILK（整合素連接激酶）是關鍵因素，可能通過激活AKT/mTOR信號通路調節線粒體復合體I基因轉錄。共聚焦顯微鏡和共免疫沉淀實驗顯示，CD177+細胞中CD11b與ILK的相互作用更強（圖4-K），且ILK與AKT存在顯著相互作用并伴隨AKT和mTOR的磷酸化（圖4L）。使用ILK、AKT和mTOR的抑制劑和激動劑進行實驗，結果表明ILK-AKT-mTOR軸是驅動CD177+細胞中線粒體復合體I激活的關鍵途徑。抑制這些信號分子可降低CD177+細胞中NDUFS1的表達和OXPHOS活性，而激活則產生相反效果（圖4G-L）。這些結果揭示了CD177/MAC-1復合體通過ILK激活AKT/mTOR信號通路，促進CD177+中性粒細胞中的OXPHOS。

圖 4

5. 高效和選擇性復合物I抑制劑IACS- 010759減輕小鼠IRI癥狀
研究人員評估了線粒體復合體I抑制劑IACS對CD177+中性粒細胞的抗炎效果。結果顯示， 20和50 nmol/L 的IACS顯著降低了人類CD177+中性粒細胞的氧氣消耗率（OCR）（圖5A），并且降低了ROS、NET形成以及CAMP和LTF的表達。為評估靶向OXPHOS是否能有效減輕肺IRI，C57BL/6小鼠在手術前3小時通過靜脈注射接受了1 mg/kg 的IACS，結果表明，IACS處理顯著減輕了肺損傷評分（圖5B）。為確認系統性IACS給藥會影響體內中性粒細胞的線粒體功能，研究人員對IACS處理和未處理IRI肺的中性粒細胞進行了scRNA-seq測序。經過質量控制和數據整合后，研究人員獲得了11,150個Cd177+細胞（IACS組：2,363個，對照組：8,787個；圖5C）。IACS處理組中Cd177+細胞的比例顯著降低（圖5D），且OXPHOS、ETC和脫顆粒相關基因評分均有所降低（圖5E）。表明IACS可以在體內外抑制Cd177+中性粒細胞的激活。此外，研究人員采用原位左肺移植大鼠模型來模擬長時間冷缺血再灌注損傷。左供肺在4℃下保存18小時后移植，再灌注2小時后取出移植肺（圖5F）。接受IACS治療的受體大鼠顯示出損傷減輕和肺泡結構得以保留（圖5G），且浸潤性中性粒細胞和NETs更少（圖5H）。IACS還保護肺部免受再灌注后肺水腫的影響，改善肺順應性，降低阻力，并增強氧合（圖5I）。這些結果表明，通過抑制線粒體復合體I來靶向氧化磷酸化是一種緩解肺缺血再灌注損傷的可行治療策略。

圖 5

結語
本研究聚焦于CD177+中性粒細胞在肺缺血再灌注損傷（IRI）中的作用。發現其炎癥基因表達增加和NETs形成與IRI密切相關。CD177/MAC-1復合體通過激活AKT/mTOR軸，增加線粒體復合體I表達，促進OXPHOS。使用復合體I抑制劑IACS在小鼠和大鼠模型中減輕了肺損傷。此外，移植后4小時受者血液中的CD177+中性粒細胞可作為3級PGD的潛在生物標志物。研究還揭示了CD177+中性粒細胞在多種無菌性炎癥狀態下的擴增現象。盡管CD177+中性粒細胞的擴增與多種疾病的發生和嚴重程度相關，但其作為治療靶點的潛力尚未被充分挖掘。研究結果表明，靶向OXPHOS可能是一種有效的治療策略，但需要進一步研究以減少潛在的不良影響。

參考文獻：
Wu J, Gao P, Yang C, et al.Targeting mitochondrial complex I of CD177+ neutrophils alleviates lung ischemia-reperfusion injury. Cell Rep Med. 2025 May 20;6(5):102140. doi: 10.1016/j.xcrm.2025.102140 . PMID: 40398393; PMCID: PMC12147905.