DAP-seq技術助力揭示番茄果實類黃酮生物合成的新機制

2025年9月9日，浙江大學汪俏梅教授團隊在Plant Communications （IF: 11.6）上在線發表了題為SlBES1-mediated brassinosteroid signaling suppresses flavonoid biosynthesis in tomato fruit的研究論文，該研究借助DAP-seq技術鑒定了SlBES1及其同源基因SlBZR1的全基因組靶基因，揭示其對番茄果實類黃酮合成的調控作用及機制，為番茄品質改良提供理論依據。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術支持。

 

 
文章主要內容

 

研究背景
番茄（Solanum lycopersicum）是一種重要的蔬菜作物，其果實色澤和營養價值備受關注。果實顏色主要由果肉的類胡蘿卜素和果皮的黃酮類物質共同決定。但由于現代栽培番茄的黃酮含量普遍較低，且兼具植物抗逆（紫外防護、抗生物脅迫）與人類健康益處（抗氧化、抗炎），因此類黃酮被視為評估番茄果皮顏色和營養價值的核心指標。目前雖然已知類黃酮合成通路（以苯丙氨酸為前體，SlCHS為關鍵限速酶，SlMYB12為核心調控因子）及BR信號通路（SlCYP90B3為合成限速基因，SlBES1/SlBZR1為核心轉錄因子），但BR調控番茄類黃酮合成的分子機制仍不清楚。
主要研究結果
1、BR抑制類黃酮合成
本研究通過外源EBL處理番茄果實，結合高效液相色譜（HPLC）檢測果實表皮類黃酮（以NarCh為指標）含量及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測類黃酮相關基因（SlMYB12、SlCHS1、SlCHS2、SlF3'H）表達，結果顯示外源EBL處理能顯著抑制番茄果皮類黃酮的積累。然后進一步構建了BR生物合成限速酶基因SlCYP90B3的過表達和RNA干擾系進行驗證，結果表明內源BR通過SlCYP90B3負調控類黃酮合成。

 

 
2、BR信號轉導組分參與調控類黃酮的生物合成
BZR轉錄因子在油菜素內酯（BR）信號通路中發揮關鍵作用，其中SlBES1和SlBZR1是具有正向調控功能的轉錄因子。為進一步明確SlBES1和SlBZR1在類黃酮生物合成中的功能，研究團隊構建了SlBZR1和SlBES1的過表達株系（SlBES1-OE和SlBZR1-OE），單基因敲除突變體（bes1、bzr1）及雙基因敲除突變體（bzr1 bes1）。結果表明，與野生型相比，SlBES1-OE果實類黃酮含量顯著降低，類黃酮相關基因表達顯著下調；bes1及bzr1 bes1果實類黃酮含量顯著升高，相關基因表達顯著上調，且雙突變體效果強于bes1單突變體；而SlBZR1-OE與bzr1的類黃酮含量無明顯差異，表明SlBES1在類黃酮合成調控中起主導作用。采用相同方法，構建SlBIN2-OE與CRISPR/Cas9 敲除（bin2）材料，結果表明SlBIN2正調控番茄果實類黃酮合成，與SlBES1的負調控作用相反。

 

3、SlBES1直接結合并抑制類黃酮合成基因表達
為解析SlBES1抑制類黃酮生物合成的分子機制，研究團隊克隆了類黃酮生物合成相關基因SlCHS1、SlCHS2和SlF3'H的啟動子序列。Y1H、ChIP-qPCR和Dual-luc實驗結果表明，SlBES1可與類黃酮合成基因啟動子結合抑制類黃酮合成基因的轉錄。

 

 
4、SlMYB12介導SlBES1的層級轉錄調控
通過對紅果番茄品種（SlMYB12功能正常）和粉果番茄品種（SlMYB12功能缺陷）的MG期果實施加EBL，發現BR對類黃酮合成的調控依賴SlMYB12。進一步Y1H、ChIP-qPCR及雙熒光素酶實驗驗證，顯示SlBES1與SlMYB12啟動子的互作及調控作用，發現SlBES1可在體外和體內直接結合SlMYB12啟動子的E-box區域，且顯著抑制SlMYB12啟動子的熒光素酶活性，表明SlBES1直接抑制SlMYB12轉錄。VIGS結果表明，在bes1背景下敲除SlMYB12可削弱bes1的高類黃酮含量表型。這些結果表明，SlBES1可以通過SlMYB12層級轉錄調控類黃酮生物合成。

 

 
5、SlBZR1協同SlBES1抑制類黃酮合成
為了進一步確定SlBES1、SlBZR1在番茄類黃酮生物合成下游基因轉錄中的作用，團隊進行了Dual-luc實驗。結果顯示SlBZR1單獨作用時對上述基因啟動子活性無顯著影響；而SlBES1與SlBZR1共表達時，對SlMYB12、SlCHS1、SlCHS2啟動子的抑制作用顯著強于SlBES1單獨作用，表明SlBZR1協同增強SlBES1對類黃酮合成的抑制作用。

 

 
6、SlBES1與SlBZR1在類黃酮/類胡蘿卜素通路中功能分化
為了鑒定SlBES1和SlBZR1參與類胡蘿卜素和類黃酮代謝調控的直接靶點，研究團隊通過RNA-seq和DAP-seq進行了聯合分析并對它們的靶基因進行了全面比較，結果表明，與野生型相比，bzr1 果實中類胡蘿卜素合成基因（如SlPSY1、PDS）表達顯著下調，而bes1及bzr1 bes1 果實中類黃酮合成基因（如SlCHS1、SlF3'H）表達顯著上調，表明SlBZR1主要正調控類胡蘿卜素合成通路，SlBES1主要負調控類黃酮合成通路，二者在番茄果實兩類主要色素代謝中功能分化。

 

 
7、SlBES1變異與番茄馴化中類黃酮合成分化相關
采用SNP分析鑒定SlBES1啟動子及SlBZR1編碼區的自然變異，結合356份番茄材料的類黃酮含量單性狀GWAS的方法，發現SlBES1的hap1-CA單倍型主要存在于低類黃酮含量材料中，其變異與類黃酮含量顯著關聯；而SlBZR1變異與類黃酮含量無顯著關聯，表明SlBES1變異是番茄馴化過程中類黃酮含量分化的重要遺傳因素。

 

 
綜上所述，本研究闡明了SlBES1通過直接靶向類黃酮合成酶基因轉錄抑制，以及通過SlMYB12級聯轉錄調控類黃酮生物合成的分子機制，同時聯合DAP-seq和轉錄組數據解析了SlBES1及其同源基因SlBZR1在調控次生代謝和果實品質中的精細協作和分工。為番茄果色調控和類黃酮生物強化提供理論基礎。