包裝腺相關病毒（AAV）的操作流程

維真生物采用的 AAV 包裝系統為改良版的 AAV 無輔助病毒系統（AAV Helper-Free System），該系統包括載體質粒（含有目的基因表達盒，其兩端是 AAV2 的反向末端重復序列）、包裝質粒（反式提供具有 AAV 復制和包裝功能的蛋白 Rep 和 Cap）、輔助質粒（含有輔助病毒 Ad5 的重要元件 E1a、E1b、 E2a、E4 等）和 1 株包裝細胞（HEK293T cell）。

1、基因克隆

獲取外源基因并將其構建至腺相關病毒載體。

2、病毒包裝

將 攜 帶 外 源 基 因 的 重 組 質 粒 與 輔 助 質 粒 Ad Helper Vector 和 pAAV rep/cap Vector 共轉染包裝細胞 HEK293T ，轉染 72h 后細胞內產生大量的重組病毒。

3、收毒

分別收獲培養基上清與細胞沉淀，用 PEG8000 沉淀培養基上清中的病毒，裂解細胞沉淀收毒，合并從細胞沉淀和上清中得到的病毒。

4、純化濃縮

碘克沙醇法對病毒進行純化。碘克沙醇密度梯度離心，可以有效地將有感染力的病毒與空衣殼病毒及其他細胞雜質分離開，將有感染力的病毒由 10% 富集到 90% 以上。純化完成后，再將收集到的病毒液置于超濾管中進行濃縮。

5、QC

① qPCR 法檢測病毒滴度

② PCR 法檢測病毒特異性

③ 銀染法檢測病毒純度