P-STAT1的序列、激活機制及做出理想WB條帶的方法
STATs，全稱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Signal transducer and activator of transcription proteins），既是細(xì)胞質(zhì)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子，又是細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄激活子。目前，已知有七種類型的STAT蛋白。它們參與不同的生物學(xué)過程，如免疫、細(xì)胞分裂、細(xì)胞死亡和腫瘤形成。STAT1是細(xì)胞對干擾素（IFN）反應(yīng)的主要介質(zhì)。研究者破壞細(xì)胞和小鼠的STAT1基因后，觀察到它們對IFN的刺激不再反應(yīng)，而對其它細(xì)胞因子的仍舊保持反應(yīng)，以此判斷STAT1對IFN途徑具有特異性。它通過在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)導(dǎo)I型IFN（IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω）、II型IFNγ和III型IFNλ的信號，在對抗病毒和分枝桿菌的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
STAT1由六個不同的區(qū)域組成：
（1）螺旋N-末端結(jié)構(gòu)域（ND），它對DNA上相鄰STAT二聚體之間的相互作用很重要；
（2）與調(diào)節(jié)蛋白相互作用的卷曲線圈（CC）結(jié)構(gòu)域；
（3）用于識別靶基因的特異性DNA序列的DNA結(jié)合域（DBD）；
（4）參與核輸出和DNA結(jié)合的螺旋連接體（LK）結(jié)構(gòu)域；
（5）用于受體結(jié)合和二聚化的Src同源性2（SH2）結(jié)構(gòu)域；
（6）C末端反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），其包含在轉(zhuǎn)錄激活時被磷酸化的特定殘基。
STAT1與STAT家族成員的激活方式相似，都是通過一類與IFN受體相關(guān)的非受體酪氨酸激酶Janus激酶（JAKs和TYK2）在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后，磷酸化STAT1分子通過pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞核中它們激活基因轉(zhuǎn)錄。
STAT1的激活需要Y701和S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突變導(dǎo)致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延長，所以大家在研究STAT1功能的時候一般要先檢測Y701和S727的磷酸化。多種細(xì)胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激這兩個位點的磷酸化。例如，EGF處理后，JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促進二聚化和隨后向細(xì)胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在內(nèi)的幾種激酶對Ser-727的磷酸化尤為重要。
我們在檢測p-STAT1，尤其是p-STAT1（Tyr701）的時候，沒有信號或者條帶不好看，應(yīng)該怎么辦呢？
1、檢測Total STAT1
雖然STAT1分布非常廣泛，在各種組織和細(xì)胞中都有表達，但是相對表達量仍然有高低之分，下圖可以看到，相同的上樣量，在HEK-293T細(xì)胞中檢測到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核內(nèi)，樣本提取的難度增加。STAT1有兩種由其轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接產(chǎn)生的亞型：STAT1α（91kDa）和STAT1β（84kDa）。STAT1α由750個氨基酸組成，是STAT1的主要形式。STAT1β是一種短型，由712個氨基酸組成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701（Y701）和絲氨酸727（S727）殘基上有兩個磷酸化位點，而STAT1β缺乏部分TAD，僅包含Y701磷酸化位點。從total STAT1著手，先確定樣本中是否可以同時檢測到STAT1α和STAT1β，確認(rèn)了研究對象以后才能應(yīng)用正確的模型和方法。
圖3 STAT1在不同細(xì)胞的表達情況：1. HeLa細(xì)胞；2. HEK-293T；3. MCF7。上樣量20ug/孔
2、選擇合適的取樣時間
有研究表明，在IFN-β處理的細(xì)胞中，10分鐘和30分鐘內(nèi)，STAT1在Tyr-701和Ser-727處磷酸化。相反，STAT1 Ser-708磷酸化在16小時后首次被檢測到，并在24小時后達到峰值，Tyr-701磷酸化已經(jīng)大幅遞減。這可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介導(dǎo)的STAT1入核。研究者也分別用IFN-γ、IFN-λ處理細(xì)胞，隨著時間的推移， STAT1磷酸化水平呈現(xiàn)不同的變化。
當(dāng)檢測的磷酸化位點不同時，應(yīng)用不同的藥物，應(yīng)設(shè)置不同的取樣時間，最好是短時間內(nèi)多次取樣。
3、樣本提取方法
分布于細(xì)胞核內(nèi)的STAT1要怎樣檢測更方便呢？除了使用裂解能力較強的RIPA，制備樣本時超聲處理是很好的選擇。超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸為止。或者使用試劑盒提取胞核部分進行檢測。
參考文獻：
1. Manlio Tolomeo， Andrea Cavalli， Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. （2022）23: 4095.
2. J E Durbin 1，R Hackenmiller，M C Simon，et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S，et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. （2011）286(52): 44412–44423
部分相關(guān)產(chǎn)品：
STAT1由六個不同的區(qū)域組成：
（1）螺旋N-末端結(jié)構(gòu)域（ND），它對DNA上相鄰STAT二聚體之間的相互作用很重要；
（2）與調(diào)節(jié)蛋白相互作用的卷曲線圈（CC）結(jié)構(gòu)域；
（3）用于識別靶基因的特異性DNA序列的DNA結(jié)合域（DBD）；
（4）參與核輸出和DNA結(jié)合的螺旋連接體（LK）結(jié)構(gòu)域；
（5）用于受體結(jié)合和二聚化的Src同源性2（SH2）結(jié)構(gòu)域；
（6）C末端反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），其包含在轉(zhuǎn)錄激活時被磷酸化的特定殘基。
圖1 STAT1的序列
STAT1與STAT家族成員的激活方式相似，都是通過一類與IFN受體相關(guān)的非受體酪氨酸激酶Janus激酶（JAKs和TYK2）在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后，磷酸化STAT1分子通過pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞核中它們激活基因轉(zhuǎn)錄。
圖2 STAT的激活
STAT1的激活需要Y701和S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突變導(dǎo)致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延長，所以大家在研究STAT1功能的時候一般要先檢測Y701和S727的磷酸化。多種細(xì)胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激這兩個位點的磷酸化。例如，EGF處理后，JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促進二聚化和隨后向細(xì)胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在內(nèi)的幾種激酶對Ser-727的磷酸化尤為重要。
我們在檢測p-STAT1，尤其是p-STAT1（Tyr701）的時候，沒有信號或者條帶不好看，應(yīng)該怎么辦呢？
1、檢測Total STAT1
雖然STAT1分布非常廣泛，在各種組織和細(xì)胞中都有表達，但是相對表達量仍然有高低之分，下圖可以看到，相同的上樣量，在HEK-293T細(xì)胞中檢測到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核內(nèi)，樣本提取的難度增加。STAT1有兩種由其轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接產(chǎn)生的亞型：STAT1α（91kDa）和STAT1β（84kDa）。STAT1α由750個氨基酸組成，是STAT1的主要形式。STAT1β是一種短型，由712個氨基酸組成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701（Y701）和絲氨酸727（S727）殘基上有兩個磷酸化位點，而STAT1β缺乏部分TAD，僅包含Y701磷酸化位點。從total STAT1著手，先確定樣本中是否可以同時檢測到STAT1α和STAT1β，確認(rèn)了研究對象以后才能應(yīng)用正確的模型和方法。
圖3 STAT1在不同細(xì)胞的表達情況：1. HeLa細(xì)胞；2. HEK-293T；3. MCF7。上樣量20ug/孔
圖4 HPA中STAT1表達水平，與上圖WB結(jié)果一致
2、選擇合適的取樣時間
有研究表明，在IFN-β處理的細(xì)胞中，10分鐘和30分鐘內(nèi)，STAT1在Tyr-701和Ser-727處磷酸化。相反，STAT1 Ser-708磷酸化在16小時后首次被檢測到，并在24小時后達到峰值，Tyr-701磷酸化已經(jīng)大幅遞減。這可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介導(dǎo)的STAT1入核。研究者也分別用IFN-γ、IFN-λ處理細(xì)胞，隨著時間的推移， STAT1磷酸化水平呈現(xiàn)不同的變化。
當(dāng)檢測的磷酸化位點不同時，應(yīng)用不同的藥物，應(yīng)設(shè)置不同的取樣時間，最好是短時間內(nèi)多次取樣。
圖5 IFN-β處理的纖維肉瘤細(xì)胞中Stat1激活情況
3、樣本提取方法
分布于細(xì)胞核內(nèi)的STAT1要怎樣檢測更方便呢？除了使用裂解能力較強的RIPA，制備樣本時超聲處理是很好的選擇。超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸為止。或者使用試劑盒提取胞核部分進行檢測。
參考文獻：
1. Manlio Tolomeo， Andrea Cavalli， Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. （2022）23: 4095.
2. J E Durbin 1，R Hackenmiller，M C Simon，et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S，et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. （2011）286(52): 44412–44423
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb |
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Stat1 (D4Y6Z) Rabbit mAb |
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Stat1 Antibody |
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Stat1 (42H3) Rabbit mAb |
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Phospho-Stat1 (Tyr701) (58D6) Rabbit mAb |
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Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb |
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Phospho-Stat1 (Ser727) (D3B7) Rabbit mAb |
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Phospho-Stat1 (Ser727) Antibody |
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Stat1 抗體 (C-136) |
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Stat1 抗體 (C-111): |
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Stat1 抗體 (B-9) |
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Stat1 抗體 (H-1) |
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p-Stat1 抗體 (A-2) |
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p-Stat1 抗體 (pY701.4A) |
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p-Stat1 抗體 (PSM1) |
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p-Stat1 抗體 (12C5) |
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細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒 |
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