SMI助力揭示Ewing肉瘤對免疫檢查點抑制劑的三重抵抗機制
一、文章背景
Ewing肉瘤（EwS）是一種好發于青少年的侵襲性骨腫瘤，盡管局灶期患者預后較好，但復發或轉移后的治療手段有限，生存率低，臨床亟需新的治療策略。免疫檢查點抑制劑（ICIs）在多種癌癥中取得成功，但在EwS中療效甚微，其機制尚不清楚。由于EwS發病率低，缺乏系統研究治療前后腫瘤微環境變化的樣本。本研究利用SARC028臨床試驗中罕見的治療前后配對活檢樣本，結合多重空間組學技術，系統揭示了EwS對PD-1單藥免疫治療抵抗的微環境機制。
二、研究設計
本研究依托SARC028臨床試驗的獨特樣本資源，系統分析了13位復發/難治性Ewing肉瘤（EwS）患者在免疫檢查點抑制劑pembrolizumab治療前與治療8周后的腫瘤活檢樣本。共收集到37個組織切片，構建組織芯片（TMA），開展以下分析：
- 多重免疫熒光（mIF）：定量腫瘤中不同免疫細胞亞群的浸潤程度，包括CD4⁺、CD8⁺ T細胞，FOXP3⁺調節性T細胞，CD68⁺巨噬細胞，CD20⁺ B細胞，及CD45⁺總免疫細胞。
- GeoMx DSP空間蛋白組：檢測68種蛋白的表達，評估免疫調節變化。總共分析 48個區域，包括：腫瘤區（依據NKX2.2+ 識別）、CD8⁺ T細胞區、CD68⁺巨噬細胞區與非陽性間質區。
- CosMx SMI空間轉錄組：通過單細胞水平的空間轉錄組圖譜，識別細胞亞群與空間鄰域。使用CosMx Human Universal Cell Characterization RNA Panel（1000-plex）
- 整合scRNA-seq數據：與已構建的EwS腫瘤微環境單細胞圖譜整合，進行細胞注釋。
本研究巧妙融合了三種空間組學技術，形成縱向-橫向聯動的分析框架：mIF用于定量免疫細胞浸潤，揭示免疫細胞總體變化；GeoMx DSP空間蛋白組學進一步解析免疫調節蛋白的空間表達狀態與治療應答的關系，提供蛋白水平的動態信息；CosMx SMI空間轉錄組則在單細胞分辨率下描繪細胞類型組成、空間鄰域結構及腫瘤亞群的功能狀態，揭示免疫抵抗的關鍵機制。
研究設計三、核心發現
1.Pembrolizumab未能顯著提升EwS腫瘤中免疫細胞浸潤水平
研究通過多重免疫熒光分析治療前后Ewing肉瘤腫瘤活檢樣本，評估T細胞、B細胞、巨噬細胞及調節性T細胞等免疫亞群的浸潤水平。結果顯示，pembrolizumab治療前后，腫瘤組織中CD45⁺總免疫細胞數量并無顯著變化，CD4⁺、CD8⁺、CD68⁺、FOXP3⁺等亞群數量也未見顯著波動。在個體水平上，部分患者存在免疫細胞數量升高或下降的情況，但這種變化未與治療后腫瘤體積變化顯著相關。這一結果提示，單藥抗PD-1治療難以有效激活EwS患者的抗腫瘤免疫反應，可能由于其本底免疫細胞浸潤水平低，或缺乏免疫激活所需的關鍵信號。
pembrolizumab治療不會改變EwS總免疫細胞密度2. 免疫檢查點治療誘導免疫抑制蛋白上調，提示潛在的免疫負反饋
通過GeoMx DSP空間蛋白質組技術對治療前后腫瘤組織中多個ROI區域進行蛋白表達譜分析，發現治療后樣本中多個免疫抑制相關蛋白顯著上調，包括CD163、FOXP3、CTLA4、IDO1、LAG3等。盡管整體蛋白表達譜未呈現大幅變化，仍可觀察到特定免疫調控蛋白在腫瘤或間質區增強表達的趨勢。這表明PD-1治療在EwS中可能誘導了反向免疫調節效應，增強了免疫抑制狀態。又或是加劇了TME中既有的抑制性信號，從而削弱了T細胞激活與持續效應。
空間蛋白質組分析顯示PD-1阻斷治療后免疫抑制相關蛋白表達上調3. 空間鄰域分析揭示免疫抵抗三聯征--高TGF-β、低IFN響應、低HLA-I表達
結合CosMx SMI空間轉錄組數據與整合后的scRNA-seq參考圖譜，研究構建了10種空間細胞鄰域（cellular neighborhoods, CN）。其中CN10鄰域在多個免疫治療失敗患者中反復出現，其主要由兩類腫瘤細胞亞群（c1與c4）構成。這些腫瘤細胞亞群具有顯著的TGF-β信號活性增強、HLA class I分子表達缺失、干擾素應答能力低下等特征。進一步分析顯示，HLA-I表達水平與免疫細胞浸潤程度及IFN信號呈正相關，且在EwS細胞系中可通過外源IFN-γ刺激恢復HLA-I表達。這提示CN10所代表的免疫抑制三聯征極可能是導致EwS原發性抗PD-1治療失敗的核心機制，同時也指出了可能的逆轉方向--靶向TGF-β、增強IFN響應與抗原呈遞通路。
空間分辨的腫瘤鄰域揭示驅動Ewing肉瘤抗PD-1治療抵抗的免疫抑制軸四、小結
這項研究提供了迄今為止最全面的Ewing肉瘤免疫微環境空間圖譜，首次明確了治療失敗后腫瘤躲避免疫的三重機制：TGFβ激活、IFN反應缺失、HLA-I表達降低。該文章也提出了幾點建議：
- 聯合療法是未來方向，例如聯合TGFβ抑制劑、放療、激活IFN通路等
- 考慮非HLA依賴的免疫策略，如CAR-T等
- 空間組學為研究罕見腫瘤療效耐藥提供新的研究路徑
- 在免疫治療臨床試驗中，動態獲取患者治療前后的腫瘤樣本是至關重要的。
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