基因編輯技術(shù)的原理及其在基因篩查、動物細(xì)胞模型構(gòu)建等中的應(yīng)用

同源重組技術(shù)（homologous recombination，HR）是較早使用的基因編輯技術(shù)，其原理是將外源性目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，通過同源序列交換，使外源性 DNA 片段取代原位點上的基因，從而達(dá)到使特定基因失活或修復(fù)缺陷基因的目的。由于 HR 效率極低，且出錯率高，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。

20 世紀(jì) 80 年代末、90 年代初，人們發(fā)現(xiàn)通過在特定的基因組靶點誘導(dǎo)雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB），能在染色體水平上實現(xiàn)高效和準(zhǔn)確的基因修飾。DSB 被誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)將啟動兩種主要的修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）。NHEJ 不依賴模板直接連接 DNA 兩端，可以在 DSB 位點有效產(chǎn)生不同長度片段的插入或缺失，通常導(dǎo)致基因功能失活；而在 HDR 中，斷裂鏈依賴于模板進(jìn)行定向修復(fù)，可以實現(xiàn)特定位點的精確插入、缺失或者堿基置換。
 

此后，科學(xué)家便專注于開發(fā)各種基于核酸內(nèi)切酶機(jī)制的基因編輯技術(shù)，以實現(xiàn)對特定基因組位點 DSB的精確誘導(dǎo)。

主要基因編輯技術(shù)及原理 1. 鋅指核酸酶（ZFN）

• 結(jié)構(gòu)：由 “鋅指蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
• 原理：
  • 鋅指蛋白通過識別特定的 DNA 堿基序列（每 3 個堿基對應(yīng)一個鋅指結(jié)構(gòu)），精準(zhǔn)結(jié)合到目標(biāo)基因位置。
  • 兩個 ZFN 分子分別結(jié)合到目標(biāo)序列的兩側(cè)，F(xiàn)okI 核酸酶在二聚化后發(fā)揮活性，切斷雙鏈 DNA。
  • 細(xì)胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）修復(fù)斷裂的 DNA，從而實現(xiàn)基因的插入、刪除或替換。

2. 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）

• 結(jié)構(gòu)：由 “TALE 蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
• 原理：
  • TALE 蛋白的識別單元由 34 個氨基酸組成，其中第 12 和 13 位氨基酸（重復(fù)可變雙殘基，RVD）決定其識別的堿基（如 NI 識別 A，NG 識別 T 等），通過串聯(lián)不同 RVD 的單元，可精準(zhǔn)識別任意 DNA 序列。
  • 與 ZFN 類似，兩個 TALEN 分子分別結(jié)合目標(biāo)序列兩側(cè)，F(xiàn)okI 二聚化后切割 DNA，再通過細(xì)胞修復(fù)機(jī)制實現(xiàn)基因編輯。

3. CRISPR-Cas 系統(tǒng)（目前應(yīng)用最廣泛）

• 核心組成：CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）和 Cas（CRISPR 相關(guān)蛋白，如 Cas9）。
• 原理：
  • 識別階段：人工設(shè)計的 sgRNA（單引導(dǎo) RNA）通過堿基互補(bǔ)配對，精準(zhǔn)結(jié)合到目標(biāo) DNA 序列，同時引導(dǎo) Cas9 蛋白定位到該位置。
  • 切割階段：Cas9 蛋白具有核酸酶活性，可在 sgRNA 結(jié)合的位置切斷雙鏈 DNA，產(chǎn)生平末端斷裂。
  • 修復(fù)階段：
    • 非同源末端連接（NHEJ）：細(xì)胞快速修復(fù)斷裂，但容易引入堿基的插入或缺失，導(dǎo)致基因功能失活（常用於敲除基因）。
    • 同源重組（HDR）：若提供含目標(biāo)序列的同源模板，細(xì)胞會以模板為參照修復(fù) DNA，實現(xiàn)基因的精準(zhǔn)插入或替換（常用於基因敲入）。