AAV病毒包裝流程解析

AAV（腺相關病毒）是一種常用于基因治療和科研的非致病性病毒載體，其包裝流程涉及多個關鍵步驟，以下是詳細的操作流程及要點：

一、載體構建與準備
1. AAV 載體質粒設計
目的基因克隆：將目標基因（如治療性基因、報告基因）插入到 AAV 載體質粒中，需位于反向末端重復序列（ITR）之間，確保基因表達。
2. 質粒提取與純化
使用無內毒素質粒提取試劑盒（如 Qiagen EndoFree Plasmid Kit），確保質粒純度（OD260/280≈1.8-2.0），避免內毒素影響細胞轉染效率和病毒活性。

二、細胞培養與轉染
1. 宿主細胞選擇
常用細胞系：HEK293 細胞（貼壁細胞，易轉染且產毒效率高）、HEK293T 細胞（含 SV40 大 T 抗原，適用于某些載體）。
2. 三質粒共轉染
轉染方法：鈣磷共沉淀法：經典方法，成本低，適用于大規模生產，但轉染效率受 pH 和溫度影響；脂質體轉染法（如 Lipofectamine 3000）：效率高，操作簡便，適合實驗室小規模包裝。
質粒比例：載體質粒：輔助質粒：腺病毒輔助質粒≈1:1:1（或按優化比例），總轉染量根據細胞密度調整（如 10 cm 培養皿用 10-15 μg 質粒）。
轉染后培養：轉染 4-6 小時后更換新鮮培養基，繼續培養 48-72 小時，觀察細胞病變（CPE）跡象（如變圓、脫落）。

三、病毒生產與收獲
1. 細胞裂解與病毒釋放
收獲時間：轉染后 48-96 小時（根據細胞狀態確定，過早產毒量低，過晚細胞裂解嚴重）。
裂解方法：
反復凍融法：-80℃/37℃凍融 3 次，破壞細胞膜釋放病毒。
超聲破碎法：適用于大規模生產，但需控制功率避免病毒失活。
化學裂解：使用 Triton X-100 或 NP-40 等去污劑，結合酶消化（如 DNase I 降解基因組 DNA）。
2. 粗提液制備
裂解液離心（4℃、10000×g、15 分鐘），收集上清液，用 0.45 μm 濾膜過濾去除細胞碎片，獲得粗提病毒液。

四、病毒純化
1. 氯化銫（CsCl）密度梯度離心
經典方法：配制 CsCl 溶液（密度 1.35-1.40 g/mL），與粗提液混合后超速離心（4℃、100000×g、16-20 小時）。病毒顆粒在密度梯度中形成白色條帶，用針頭穿刺管壁收集。透析去除 CsCl，用 PBS 或病毒保存液（含 10% 甘油）濃縮。
2. 層析法純化
親和層析：利用 AAV 衣殼蛋白與肝素的結合特性，通過肝素瓊脂糖柱純化，特異性高，適合規模化生產。
離子交換層析：根據衣殼蛋白電荷差異分離，需優化緩沖液 pH 和離子強度。
凝膠過濾層析：按病毒顆粒大小分離，可同時去除雜質和濃縮病毒。
3. 超濾濃縮
使用 100 kDa 分子量截留的超濾管（如 Amicon Ultra），4℃、3000×g 離心濃縮病毒液，同時置換緩沖液。

五、病毒滴度測定與質量控制
1. 滴度測定方法
qPCR 法（常用）：
提取病毒基因組 DNA，設計針對 ITR 或目的基因的引物，通過 qPCR 定量病毒基因組拷貝數（vg/mL）。
需制備標準品（已知拷貝數的質粒）建立標準曲線。
斑點雜交（Dot Blot）：半定量方法，靈敏度較低，適用于初步篩選。
感染性滴度測定（TTI）：用病毒感染細胞，通過報告基因（如 GFP）或 RT-PCR 檢測感染細胞比例，計算感染性滴度（IU/mL），反映病毒活性。
2. 質量控制指標
純度檢測：SDS-PAGE 或 Western blot 檢測衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3），無明顯雜蛋白條帶。
無菌檢測：細菌、真菌培養及內毒素檢測（如鱟試劑法，內毒素≤10 EU/mL）。
活性驗證：體外感染細胞，觀察目的基因表達效率；體內實驗需驗證組織靶向性和安全性。

六、病毒保存與分裝
分裝：按實驗需求分裝為小劑量（避免反復凍融），常用保存液為 PBS（含 0.01% BSA 或 10% 甘油），防止病毒聚集。
保存條件：-80℃長期保存（避免 - 20℃，易導致病毒失活），使用時冰上融化并瞬時離心。