EMSA助力揭示楊樹扦插生根中LBD16介導通路的保守性
2023年6月15日，北京林業大學林金星研究組、李曉娟研究組，中國科學院分子植物科學卓越創新中心徐麟研究組聯合在The Innovation Life期刊上在線發表了題為“Transcriptome framework of root regeneration reveals the conservation of the LBD16-mediated pathway in poplar cuttings”的文章，揭示了楊樹扦插中不定根再生的轉錄組圖譜，并通過EMSA等一系列實驗證明了LBD16在促進不定根再生方面的保守作用。
扦插再生不定根是一種非常實用的樹木無性繁殖方法。楊樹是生長快、生物量大的重要樹種，廣泛應用了枝條扦插再生不定根技術。為解楊樹扦插中不定根再生的機制，作者對84K楊（Populus alba × Populus glandulosa）的莖損傷區域進行了時序RNA測序（RNA-seq），基因集富集分析（GSEA）顯示，在不定根再生過程中，光合作用相關基因表達下調，損傷和氧化應激反應相關基因、乙烯激活信號通路和脫落酸激活信號通路相關基因均快速上調，這些信號通路可能參與了損傷后莖的保護作用。與硝酸鹽跨膜轉運蛋白活性和鉀離子跨膜轉運蛋白活性相關的基因也迅速上調，內質網與細胞質生長素運輸相關基因表達上調，與根、分生組織發育和分生組織維持相關的基因也在扦插損傷部位上調。通過分析不定根器官形成過程中與細胞命運轉變有關的關鍵基因，發現PagWOX11.1a/b和PagLBD16.2a/2b/3a表達上調，qRT-PCR分析證實了PagWOX11.1a/b和PagLBD16.3a/b在莖切割后的表達模式。
進一步研究發現許多擬南芥同源基因，在根頂端分生組織或側根器官形成中發揮干細胞生態位活性和細胞分化功能。此外，生長素信號通路、生長素運輸和生長素生物合成相關基因在根再生過程中均表達上調。這表明，在不同物種的扦插過程中，與根系再生有關的基因網絡可能是相似的。
隨后作者重點研究了LBD16在楊樹不定根再生中的作用，對LBD基因進行系統發育分析，結果顯示在楊柳屬中存在兩個AtLBD16同源基因分支，即LBD16.2分支和LBD16.3分支，均位于IIIA亞類。雜交84K楊基因組包含4個LBD16基因，毛果楊（Populus trichocarpa）基因組包含兩個LBD16基因，過表達PtrLBD16.3 (35Spro:PtrLBD16.3)顯著增強了84K楊的不定根再生，這表明LBD16蛋白在促進不定根再生過程中可能具有進化保守性。
楊樹屬植物LBD16.2和LBD16.3基因的啟動子區存在許多保守區域，包括生長素反應元件（AuxREs）和WOX結合的順式作用元件（WOXCEs）。 qRT-PCR分析結果顯示，用合成生長素1-萘乙酸（NAA）處理斷枝損傷區域，PagLBD16.3a/b表達上調，在84K楊中過表達PagWOX11.1a （35Spro:PagWOX11.1a ）基因，PagLBD16.3a/b也表達上調。染色質免疫沉淀（ChIP）和電泳遷移（EMSA）實驗證實了PagWOX11.1a蛋白可能與PagLBD16.3a啟動子區的一個WOXCE結合。這些結果表明，在楊樹再生不定根過程中，生長素和WOX11可能上調LBD16的表達，這與擬南芥中WOX11-LBD16的分子途徑類似。
EMSA實驗中探針序列為：5'-CATATTTGCATAAACCCATTAATAAATGTTCCCTGAA-3'，分別設置了不同濃度的冷探針與生物素標記的探針進行競爭，冷探針量越多，結合條帶越淺，這說明蛋白和探針有結合作用。
綜上所述，本研究以及其他楊樹WOX11和擬南芥的研究結果表明，生長素、WOX11和LBD16促進扦插不定根再生的調控網絡可能具有進化保守性。因此，LBD16有望作為提升不同物種扦插生根效率的分子工具。
扦插再生不定根是一種非常實用的樹木無性繁殖方法。楊樹是生長快、生物量大的重要樹種，廣泛應用了枝條扦插再生不定根技術。為解楊樹扦插中不定根再生的機制，作者對84K楊（Populus alba × Populus glandulosa）的莖損傷區域進行了時序RNA測序（RNA-seq），基因集富集分析（GSEA）顯示，在不定根再生過程中，光合作用相關基因表達下調，損傷和氧化應激反應相關基因、乙烯激活信號通路和脫落酸激活信號通路相關基因均快速上調，這些信號通路可能參與了損傷后莖的保護作用。與硝酸鹽跨膜轉運蛋白活性和鉀離子跨膜轉運蛋白活性相關的基因也迅速上調，內質網與細胞質生長素運輸相關基因表達上調，與根、分生組織發育和分生組織維持相關的基因也在扦插損傷部位上調。通過分析不定根器官形成過程中與細胞命運轉變有關的關鍵基因，發現PagWOX11.1a/b和PagLBD16.2a/2b/3a表達上調，qRT-PCR分析證實了PagWOX11.1a/b和PagLBD16.3a/b在莖切割后的表達模式。
進一步研究發現許多擬南芥同源基因，在根頂端分生組織或側根器官形成中發揮干細胞生態位活性和細胞分化功能。此外，生長素信號通路、生長素運輸和生長素生物合成相關基因在根再生過程中均表達上調。這表明，在不同物種的扦插過程中，與根系再生有關的基因網絡可能是相似的。
隨后作者重點研究了LBD16在楊樹不定根再生中的作用，對LBD基因進行系統發育分析，結果顯示在楊柳屬中存在兩個AtLBD16同源基因分支，即LBD16.2分支和LBD16.3分支，均位于IIIA亞類。雜交84K楊基因組包含4個LBD16基因，毛果楊（Populus trichocarpa）基因組包含兩個LBD16基因，過表達PtrLBD16.3 (35Spro:PtrLBD16.3)顯著增強了84K楊的不定根再生，這表明LBD16蛋白在促進不定根再生過程中可能具有進化保守性。
楊樹屬植物LBD16.2和LBD16.3基因的啟動子區存在許多保守區域，包括生長素反應元件（AuxREs）和WOX結合的順式作用元件（WOXCEs）。 qRT-PCR分析結果顯示，用合成生長素1-萘乙酸（NAA）處理斷枝損傷區域，PagLBD16.3a/b表達上調，在84K楊中過表達PagWOX11.1a （35Spro:PagWOX11.1a ）基因，PagLBD16.3a/b也表達上調。染色質免疫沉淀（ChIP）和電泳遷移（EMSA）實驗證實了PagWOX11.1a蛋白可能與PagLBD16.3a啟動子區的一個WOXCE結合。這些結果表明，在楊樹再生不定根過程中，生長素和WOX11可能上調LBD16的表達，這與擬南芥中WOX11-LBD16的分子途徑類似。
EMSA實驗中探針序列為：5'-CATATTTGCATAAACCCATTAATAAATGTTCCCTGAA-3'，分別設置了不同濃度的冷探針與生物素標記的探針進行競爭，冷探針量越多，結合條帶越淺，這說明蛋白和探針有結合作用。
綜上所述，本研究以及其他楊樹WOX11和擬南芥的研究結果表明，生長素、WOX11和LBD16促進扦插不定根再生的調控網絡可能具有進化保守性。因此，LBD16有望作為提升不同物種扦插生根效率的分子工具。
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