懸浮細胞電穿孔轉(zhuǎn)染法實驗步驟

[實驗原理]
  當細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運用這一技術，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導方法，電穿孔已被廣泛用于各種細胞類型，包括細菌、酵母、植物和動物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細胞。與其他常用的導入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點。首先，不必象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術培訓和昂貴的設備，可以一次對成百萬的細胞進行注射。第二，與用化學物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學副作用。第三，因為電穿孔是一種物理方法，較少依賴細胞類型，因而應用廣泛。實際上，對大多數(shù)細胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學方法高得多。

除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈沖也能引起細胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規(guī)的化學融合方法高10到100倍，最近，貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時細胞的骨架成分和細胞器的動力學重排。

[儀器、材料和試劑]
（一）儀器：
脈沖發(fā)生器，樣品池：一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極，CO2培養(yǎng)箱，離心機，顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細管，離心管等。
（二）材料：
（三）試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀　1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）　10mmol/L HEPES　調(diào)節(jié)pH至7.3
融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇　2mmol/L HEPES　調(diào)節(jié)pH至7.3

[方法與步驟]
一．懸浮細胞的電穿孔法：
1電穿孔進行基因轉(zhuǎn)移
電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉(zhuǎn)移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進行，只需把外源DNA換頁所需分子即可。
1.1　使細胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對數(shù)生長中期的細胞，并用腺酶處理。
1.2　在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細胞時，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細胞。
1.3　計數(shù)細胞，在PM中，濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml。
1.4　將DNA加到細胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5　在電穿孔裝置上設置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設備是CD脈沖型發(fā)生器，設定電容和并聯(lián)電阻，以達到合適的τ值。
1.6　將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7　電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。
1.8　在測定轉(zhuǎn)移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養(yǎng)的時間不同。
2檢測電穿孔效率和細胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標細胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細胞懸液中加30μl臺盼藍，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定攝取熒光標記葡聚糖的百分數(shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了臺盼藍），測定細胞存活的百分數(shù)。
2.7 在各種電場設定值下重復實驗，畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的合適條件。