T細胞的六種檢測分析方法介紹

由于T細胞具有多種亞型，所以研究膜結合T細胞受體的技術困難，但在某些情況下，您希望能夠做到這一點，例如分析哪些免疫記憶已被誘導以測量個體對特定抗原的反應程度。此時， 有多種方法可以實現，主要分為兩大類：一種是通過測量特征性反應（例如細胞因子分泌）來檢測 T 細胞對刺激作出反應的激活，另一種是通過細胞的特異性來分析T細胞受體。



下面總結了一下 T細胞分析的6種方法：

1. 限制稀釋培養
該技術涉及通過使用不同稀釋度的細胞來測量對特定抗原產生反應的 T 細胞的頻率，然后測量無反應的孔數。
不用過多計算，簡而言之，每個孔中活性 T細胞的分布應遵循泊松分布隨機分布原則。我們可以使用這些信息來計算我們擁有的活躍 T 細胞的數量。從泊松分布中我們知道，如果反應陰性的孔比例為 37%，那么每個孔中平均有一個抗原特異性 T 細胞。因此讀取產生 37% 陰性孔的細胞數，然后我們可以計算響應細胞的頻率。例如，如果以每孔 5000 個細胞接種細胞導致 37% 的細胞呈陰性，我們知道我們有 1/5000 個活躍細胞的頻率。啟動或免疫小鼠后，頻率相應增加，就表明抗原正在驅動增殖。

2. ELISPOT
如果需要對細胞進行表型分析，有限稀釋培養法就顯得費力些。此時可以可以通過細胞因子的產生來測量 T 細胞的反應，即：ELISPOT（酶聯免疫斑點）進行檢測。
方法步驟如下：在使用非反應性血清進行封閉之前，可以在 PVDF（聚偏二氟乙烯）覆蓋的微孔板上涂上單克隆或多克隆抗體，并將板上的 T 細胞與一種或多種物質一起培養以激活細胞因子的分泌。然后細胞因子被包被的抗體捕獲。接下來，在添加二抗之前清洗板以去除碎片、未結合的抗體和培養基，二抗與顯色（著色）底物（通常是帶有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的鏈霉親和素）偶聯，然后再次洗滌。然后，您可以將目的細胞因子視為可見點，并分別使用顯微鏡手動或自動使用自動閱讀器對其進行計數。這種方法的缺點在于 雖然量化產生抗體的 T 細胞的數量方面相對較多，但在描述單個細胞的細胞因子產生譜時仍然受到限制。

3. 細胞內染色
細胞內染色是指在固定和透化細胞之前用蛋白質轉運抑制劑（例如莫能菌素或布雷菲爾德菌素）處理來抑制細胞因子的分泌，并針對您的細胞因子的熒光標記抗體，并通過流式細胞術進行測量的方法。其缺點在于會殺死細胞 。

4. 細胞因子捕獲
細胞因子捕獲法的原理是來自不同抗體的兩個重鏈和輕鏈對組合在一起，得到帶有兩個不同配體的兩個抗原結合位點的雜交抗體。這些雙特異性抗體可用于檢測細胞因子。一種配體是 T 細胞特異的標記物，另一種是目標細胞因子特異的標記物。活化的 T 細胞用蛋白質轉運抑制劑處理，因此細胞因子在細胞內積累。然后使用雜交抗體來捕獲和檢測 T 細胞表面標記的細胞因子。甲雜交抗體可用于執行此操作。雜交抗體由對目標細胞因子和常見細胞表面蛋白（如 MHC I 類）特異的抗體制成。雜交抗體結合活化的 T 細胞。如果 T 細胞分泌細胞因子，則與細胞表面結合的雜交抗體會捕獲它們。然后使用針對目標細胞因子的標記二抗檢測分泌細胞因子的 T 細胞。

5. 四聚體染色
T 細胞反應也可以通過其受體的特異性來測量，使用熒光標記的四聚體或特定的 MHC：肽復合物。MHC ：肽四聚體由重組 MHC 分子制成，其中特定肽與生物素-鏈霉親和素結合。表達相應特異性的 T 細胞結合這些四聚體。然后對這些進行染色以進行檢測，并可以通過流式細胞術進行分析！

6. 光譜分析和生物傳感器檢測
T細胞群的多樣性可以通過光譜分析來定義。在這里，CDR3 區域通過凝膠電泳可視化，讓您可以比較表達相同 V 段的受體。然后可以使用生物傳感器測定來測量配體與其互補抗原受體的結合和解離率。
待測配體固定在鍍金表面。然后使可溶性 T 細胞受體與結合的配體接觸并結合。一段時間后，他們分離。可以使用生物傳感器實時測量發生這種情況的速率。附著和脫離的速率由生物傳感器監測，該生物傳感器可以有效進行全內反射并 結合對玻璃芯片表面偏振光源的影響來測量鍍金玻璃芯片表面分子的結合. 它檢測反射光束的角度和強度的任何波動，并將其與時間繪制成圖以創建“傳感圖” 。
也可以結合受體而不是配體。當系統飽和或達到結合和解離之間的平衡狀態時，達到最大結合后，曲線將趨于穩定，表明不再發生結合。然后可以洗掉未結合的分子，在繼續洗滌后，它們都開始從它們結合的蛋白質上脫落。測量相互作用的曲線將開始下降，顯示發生解離的速率。

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