SDS-PAGE 的實驗原理及各組分的作用

SDS-PAGE即：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術是一種根據凝膠電泳蛋白質的分子量進行蛋白分離的常用技術。

SDS-PAGE 的實驗原理
我們知道，任何帶電物質在電場中的運動取決于其凈電荷、分子半徑和外加場的大小。但是天然折疊蛋白質的的不同之處在于它們的凈電荷和分子半徑都與分子量無關。蛋白的凈電荷取決于蛋白質中正負氨基酸的總和以及蛋白質三級結構的分子半徑。 

因此，在天然狀態下，具有相同分子量的不同蛋白質會根據其電荷和 3D 形狀在電場中以不同的速度遷移。SDS-PAGE電泳技術需要做的是將蛋白質還原為線性分子來破壞三級結構，并以某種方式來掩蓋蛋白質的內在凈電荷，從而根據蛋白質的分子量進行蛋白區分。

所以，SDS-PAGE 的工作原理的實質是根據蛋白質在施加電場的影響下通過篩分基質（凝膠）的不同遷移率，根據蛋白質的分子量來分離蛋白質。



SDS在 SDS-PAGE 中的作用
SDS 是一種存在于 SDS-PAGE 樣品緩沖液中的去污劑，其中有一點沸騰，還有一種還原劑（通常是 DTT 或ββ-ME 分解蛋白質-蛋白質二硫鍵），它會破壞蛋白質的三級結構。這使折疊的蛋白質變成線性分子。

SDS 還用均勻的負電荷覆蓋蛋白質，從而掩蓋了 R 基團上的固有電荷。SDS 與線性蛋白質的結合相當均勻（大約 1.4g SDS/1g 蛋白質），SDS 也存在于凝膠中，以確保一旦蛋白質被線性化并掩蓋了它們的電荷，它們在整個運行過程中都保持這種狀態。

決定 SDS 包被蛋白質遷移率的主要因素是其分子半徑。SDS 包被的蛋白質已被證明是線性分子，寬 18 埃，其長度與其分子量成正比關系，所以分子半徑是由蛋白質的分子量的大小索決定。

凝膠基質在 SDS-PAGE 中的作用
在施加的電場中，經過 SDS 處理的蛋白質現在將根據其分子量以不同的速率向正極移動。由于凝膠基質的高摩擦環境，這些不同的流動性將被夸大。

由于聚丙烯酰胺具有化學惰性，而且它可以很容易地制成各種濃度以產生不同的孔徑，從而提供適合各種分離的條件，因此常用它作為SDS-PAGE的凝膠基質。

不連續緩沖系統解釋
為了通過凝膠將電流從陰極（負）傳導到陽極（正），顯然需要緩沖液。大多數使用不連續的Laemmli 緩沖系統。“不連續”只是意味著凝膠和罐中的緩沖液不同。

通常，系統設置有 pH 6.8 的濃縮凝膠、Tris-HCl 緩沖、Tris-HCl 緩沖至 pH 8.8 的運行凝膠和 pH 8.3 的電極緩沖液。濃縮膠的丙烯酰胺濃度較低，因為我們不希望蛋白質在這里分離，而流動膠的丙烯酰胺濃度較高，能夠阻止蛋白質的運動。
 
SDS-PAGE 的工作原理
1.堆積膠在 SDS-PAGE 中的作用
當電源打開時，pH 8.3 電極緩沖液中帶負電荷的甘氨酸離子被迫進入濃縮膠，此處的 pH 值為 6.8 。在這種環境下，甘氨酸主要轉變為兩性離子（帶中性電荷）狀態。這種電荷損失導致甘氨酸離子在電場中移動非常緩慢。

Cl- 與 Tris 反離子（現在向陽極移動）的分離產生了一個帶有陡峭電壓梯度的狹窄區域，將甘氨酸離子拉到它后面，導致遷移離子的兩個狹窄分離的前沿；高度流動的 Cl- 前沿，其次是較慢的，主要是中性甘氨酸前沿。 

凝膠樣品中的所有蛋白質的電泳遷移率介于甘氨酸和 Cl- 遷移率的極值之間，因此當兩個前沿掃過樣品孔時，蛋白質會集中到 Cl 之間的狹窄區域 - 和甘氨酸前沿。 

當蛋白質遷移時遇到運行的凝膠時，在那里 pH 值切換到 8.8。在此 pH 值下，甘氨酸分子大多帶負電荷，遷移速度比蛋白質快得多，此時，分子量的大小決定了其遷移的速度，逐漸實現分離。

蛋白分離
一旦蛋白質進入電泳凝膠，它們就會分離，因為較高分子量的蛋白質通過多孔丙烯酰胺凝膠的速度比較低分子量的蛋白質更慢。通過改變丙烯酰胺濃度，可以根據要分離的蛋白質的大小來改變凝膠中孔的大小。

典型值顯示在下表 1 中。


在SDS-PAGE中 ，對于更廣泛的分離范圍，或難以分離的蛋白質，可以使用具有不斷增加丙烯酰胺濃度的層的梯度凝膠。