Western Blot技術篇之樣品制備

Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括：
 

• 從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質提取和蛋白質濃度測量）

• 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質

• 將分離的蛋白質固定在硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上

• 封閉膜上的非特異性蛋白

• 用特異性一抗探測靶蛋白

• 與標記的化學發光或熒光分子偶聯的二抗共孵育

• 檢測反映抗原/抗體結合的信號
• 使用軟件對目標蛋白條帶進行光密度分析

Western Blot是分子生物學和蛋白質組學中最常用的技術之一。但Western Blot是一個多步驟的操作流程，因此任何一個步驟發生錯誤，都會導致最終的結果發生變異，從而降低了該技術的可靠性和可重復性。有研究表明，Western Blot的一些關鍵步驟，例如樣品制備方法、跑膠、轉膜、抗體的選擇以及定量所用的歸一化方法，對于可再現的蛋白質印跡結果至關重要。
 

--樣品制備--

Western blot步驟中的一個經常被忽視的方面是有效的樣品制備。有效的蛋白質提取和純化步驟對蛋白質印跡實驗的結果和解釋有重要影響。為了有效地提取蛋白質，應該選擇一種合適的均質化方法，該方法可以通過細胞膜的破裂有效地釋放細胞內的內容物。另外，應該選擇最佳的裂解緩沖液以促進蛋白質的正確溶解并防止蛋白水解降解，從而獲得大量的目標蛋白質。

從以下幾個方面介紹：
樣品制備的原則
蛋白樣品的類型
蛋白樣品制備的流程
組織或細胞破碎和裂解
破碎裂解的方法
裂解液一般組成

常見裂解液成份一覽表
蛋白酶抑制劑的類型
常見的蛋白酶抑制劑一覽表

參考文獻：

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25