油菜內源基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法SN標準）使用說明
油菜內源基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法SN標準）
◆ 產品說明
轉基因檢測系列可針對食品、飼料等樣品中轉基因成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于油菜成分的檢測，檢出限為0.1%。
◆ 產品組成（ 48測試）
|
045032M | |
|
試劑 |
含量 |
|
A-PEP-P |
1000μL × 1支 |
|
NG-P |
100μL × 1支 |
|
PG-PEP-P |
100μL × 1支 |
◆ 適用儀器
熒光PCR儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等PCR擴增儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴；⑧均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑨電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：試劑準備區。
2）第二區：樣本制備區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《GB/T 19495.3-2004 轉基因產品檢測 核酸提取純化方法》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
將試劑完全解凍，各組分離心30s。
1. 試劑配制（試劑準備區，放置于冰盒中進行）：
若有N個待檢樣品，則參照下表，按照N+2個數量計算反應液用量（N個待檢樣品+1個陰性對照+1個陽性對照），渦旋混勻，離心30s，分裝于0.2mL PCR管中。
|
試劑 |
使用量 |
|
A-PEP-P |
20×(N+2)μL |
|
反應液總體積 |
20×(N+2)μL |
- 模板制備（樣本制備區）
建議使用配套植物基因組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
3．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）
在步驟1中已含有反應液的PCR管中分別加入5μL模板，順序為NG-P、待測樣品模板、PG-PEP-P。渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
4. 擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
|
PCR循環 |
熒光收集位點 | ||
|
95℃ |
10分鐘 |
1個循環 |
— |
|
95℃ |
15秒 |
40個循環 |
— |
|
60℃ |
1分鐘 |
※ | |
6.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點。
◆ 結果判定
檢測樣品無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有玉米成分或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct≤30，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有油菜成分；
檢測樣品30<Ct≤40，需進行一次重復實驗，若Ct值仍處于30和40之間且呈“S”型擴增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
