real-time/qPCR 常遇到的那些事！！！（原因解讀）

通常來講，real-time PCR（ qPCR）的反應程序不需要像常規的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產物長度在 80～150 bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。 
 
SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷 PCR 產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。 
 
1、無 Ct 值出現 
 
檢測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時采集，Taqman 法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。 
引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性。 
模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 
模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。 
 
2、Ct 值出現過晚（Ct>38） 
 
擴增效率低：反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 
PCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。 
PCR 產物太長： 一般采用 80～150 bp 的產物長度。 
 
3、標準曲線線性關系不佳 
 
加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。 
標準品出現降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。 
引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。 
模板中存在抑制物，或模板濃度過高。 
 
4、負對照有信號 
 
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。 
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 
模板有基因組的污染：RNA 提取過程中避免基因組 DNA 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。 
 
5、擴增效率低 
 
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 
反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。 
反應體系中有 PCR 反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。 
 
6、擴增曲線異常，比如 S 型曲線 
 
參比染料設定不正確：MasterMix 不加參比染料時，選 NONE。 
模板的濃度太高或者降解。 
熒光染料的降解。 
 
7、定量 PCR 儀的開關機順序是怎樣的？ 
 
按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。 
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量 PCR 儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量 PCR 的收集軟件，進行實驗。 
　　 
關機順序：確認實驗已經結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR 儀主機的電源，最后關閉電腦。 
 
9、什么是 CT 值比較法？數據怎么處理？ 
 
CT 值與起始 DNA 濃度的對數成反比： 
如果：不同管之間的 PCR 反應效率相同。這些 PCR 的反應效率接近 100%。可以從上面的公式推出相對含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理后 0、24、48 小時 IL-2 基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的測定結果都是 CT 值，而沒有通過標準曲線測定總 RNA 的 pg 數。　 
　 
10、定量 PCR 基因表達的實驗數據應該如何處理？ 
 
總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。 
參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX，這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數據真正反映 PCR 進程。ROX 校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數據重現性。 
內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同時定量一個內對照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗數據可以相互比較。 
計算相對于基準樣品（Calibrator）的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0 小時和 6 小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6 小時/0 小時、患病/正常。 
 
11、怎樣判斷定量 pcr 儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？ 
 
一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。 
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行 ROI 的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。 
清除樣本加熱塊污染的步驟如下： 
用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。 
吹打數次。 
將廢液吸入廢液杯中。 
重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。 
確認反應孔中的殘留液體蒸發完。 
 
12、內標法和外標法哪種數據更精密？ 
 
是同樣可靠的。 
內標的優點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的 PCR 效率有差異。 
外標的優點在于目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的 PCR 效率有差異。 
兩相比較，內標法與外標法的數據精確度是一樣的。 

相關鏈接：

原位雜交

RT-PCR

real-time PCR

SNP