多組學分析揭示DNA低甲基化定義人組織調節性T細胞的表觀遺傳適應性

2025年7月16日，德國雷根斯堡大學Markus Feuerer教授和美因茨大學Michael Delacher 教授團隊合作，通過整合人類皮膚組織和血液中調節性T細胞（Regulatory T cells，Treg細胞）的全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質可及性測序（ATAC-seq）和轉錄組測序（RNA-seq）多組學數據，系統解析了人類皮膚組織和血液中Treg細胞的表觀遺傳特征。本研究發現皮膚Treg細胞表現出以DNA低甲基化為主的組織適應性呈現狀態，尤其發生在轉座子元件（TE）區域。進一步研究證實，血液中CCR8+ Treg細胞在DNA甲基化模式上與皮膚Treg高度相似，但在染色質可及性和基因表達上部分差異，提示其可能是從皮膚組織再循環至血液的Treg細胞。該研究首次利用多組學定義了人多組織Treg細胞的表觀遺傳適應性狀態，并提出了CCR8+ Treg作為循環中組織來源Treg的甲基化標志。相關研究成果以“DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts”為題發表在免疫學相關領域頂刊《Nature immunology》。

• 皮膚組織Treg細胞：來自7名健康女性捐贈者的皮膚組織。
• 血液Treg細胞：從10例健康女性血小板捐贈者的白細胞減除腔中分離外周血單核細胞（PBMCs），包括CCR8+ Treg、CD45RA+ naive Treg和常規T細胞（Tconv）。
• 脂肪組織Treg細胞：來自皮下脂肪，用于驗證組織保守性。

表觀多組學測序分析：

• WGBS（全基因組亞硫酸鹽測序）：用于全基因組DNA甲基化分析，覆蓋約2.8M CpG位點，中位覆蓋度2–7×。
• ATAC-seq（染色質可及性測序）：利用公開數據及自行生成的數據，分析染色質開放區域。
• RNA-seq（轉錄組測序）：分析基因表達差異，部分數據來源于公開數據庫。
• 多組學整合：通過重疊DMRs、差異可及性峰值和差異表達基因，構建“DMR–peak–gene links”關聯調控網絡。

驗證分析：

• T細胞受體（TCR）追蹤：利用scRNA-seq/scTCR-seq數據，通過TCR克隆型重疊評估細胞來源同一性。
• 小鼠模型驗證：使用光轉換Kaede小鼠（Tg(CAG-Kaede)15Kgwa）追蹤皮膚Treg細胞向引流淋巴結的遷移，并結合CCR8表達分析。

圖1：皮膚Treg細胞和血液CCR8+ Treg細胞與血液CD45RA+ Treg細胞的DNA甲基化分析

a. 流式細胞術代表性圖譜顯示人類血液、脂肪和皮膚中CD4+CD127-CD25+ Treg細胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細胞（左圖），以及人類血液與皮膚中CD4+ CD127-CD25+ Treg細胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細胞比例。
b. 分選策略示意圖顯示從1例健康女性供者中分離血液CD45RA+ Treg細胞、血液CD45RA+ Tconv細胞、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞。
c. 對來自9例健康女性供者的血液和皮膚和血液中分離的血液CD45RA+ Treg細胞（RA+ Treg細胞）、血液CD45RA+ Tconv細胞（RA+ Tconv細胞）、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞進行DNA甲基化主成分分析。
d. c中供者的人類血液CD45RA+ Treg細胞、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞中按基因組位置顯示的甲基化水平，以及與血液CD45RA+ Tconv細胞的差異分析。
e. 任意兩種細胞類型之間最顯著甲基化差異（紅色箭頭）提取細胞類型特征，從而篩選出特征區域。
f. e中所選細胞類型特征區域的DNA甲基化情況。
g. e中特征區域的細胞類型特征在由基因定義的基因組區間（上圖）和CpG島（下圖）中的分布。

（2）多組學揭示差異甲基化區域-染色質開放峰-基因表達關聯調控網絡（DMR–peak–gene links）
為建立DNA甲基化與功能調控的直接聯系，研究整合WGBS數據與已發表的scATAC-seq及bulk RNA-seq數據，構建了"DMR-peak-gene"關聯分析調控網絡，即一個基因組區域同時存在差異甲基化、差異可及性和關聯基因差異表達。在比較血液CD45RA+ naïve Treg 和Tconv細胞，共鑒定出超3600個差異甲基化區域（DMRs），其中包含TNFRSF1B、TNFRSF9、IKZF2、IKZF4、FOXP3等經典Treg功能基因。進一步整合形成了151個DMR–peak–gene links，涉及73個基因。

在Treg表征位點（如FOXP3、TIGIT、IL2RA、CTLA4、TNFRSF1B）上，WGBS揭示的低甲基化模式與ATAC-seq檢測的染色質開放及RNA-seq檢測的高表達呈現顯著負相關。此外，研究通過靶基因亞硫酸鹽測序技術，在6例獨立男性供者中驗證了FOXP3、TIGIT、IL2RA、TNFRSF1B、LRRN3和SYTL3等位點的甲基化差異。這些關聯分析揭示了甲基化變化如何通過染色質可及性調控基因表達，為理解Treg細胞功能調控提供了多組學證據鏈。
 

a. 血液CD45RA+ Treg細胞（RA+ Treg細胞）與血液CD45RA+ Tconv細胞（RA+ Tconv細胞）之間差異甲基化區域（左）、差異可及性peaks（中）和差異表達基因（右）的甲基化、染色質可及性和表達。
b. DMR–peak–gene關聯分析（n=151）中差異甲基化、可及性和表達之間的相關性。
c. 血液CD45RA+ Treg細胞和血液CD45RA+ Tconv細胞中選定DMR–peak–gene關聯的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質可及性（左下）和表達（右下）。
d. Taregt-BS測序顯示選定區域血液CD45RA+ Treg細胞與血液CD45RA+ Tconv細胞的甲基化差異。

（3）皮膚Treg細胞組織適應具有多組學特征
為研究皮膚Treg細胞的組織特異性適應過程，研究團隊鑒定出300,199個DMRs（其中298,457個為低甲基化）、8,914個差異可及性峰（3,192個高開放）和6,877個差異表達基因（4,049個高表達）。通過DMR-peak-gene關聯分析，發現1,203個三聯關聯中，813個表現為低甲基化-高開放-高表達模式，涉及TNFRSF8（CD30）、RELB、CCR8、PRDM1和BATF等關鍵轉錄因子。WGBS數據顯示，這些DMR甲基化水平變化程度遠高于染色質可及性變化，提示DNA甲基化可能是促進組織適應的"主開關"。功能富集分析表明，低甲基化關聯基因顯著富集于IL-2-STAT5信號、TNF信號、TGFβ信號等Treg細胞核心通路。值得注意的是，將皮膚Treg特征與脂肪組織Treg數據交叉驗證，發現脂肪Treg細胞中共有絕大多數低甲基化特征，證明了WGBS鑒定的表觀遺傳適應程序在不同組織的Treg細胞間具有保守性。該結果揭示，組織Treg細胞的適應過程本質上是一個以DNA去甲基化為主導的大規模表觀遺傳重編程事件，而非簡單的轉錄因子誘導表達。
 

圖3：DMR–peak–gene關聯分析定義皮膚Treg細胞發育的多組學表征。

a. 皮膚Treg細胞與血液CD45RA+ Treg細胞（血液RA+ Treg細胞）之間差異甲基化區域（左）、差異可及性峰（中）和差異表達基因（右）的甲基化、染色質可及性和表達情況。
b. DMR–peak–gene關聯（n=1,203個）中差異甲基化、可及性和基因表達之間的相關性。
c. 所選DMR–peak–gene關聯分析顯示在皮膚Treg細胞和血液CD45RA+ Treg細胞中的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質可及性（左下）和基因表達（右下）。
d. 多組學分析顯示皮膚Treg細胞特征中基因的標記基因集富集情況。

（4）bZIP和bHLH motif的甲基化模式標記皮膚Treg細胞
通過解析DMRs中的轉錄因子結合位點，研究發現在皮膚Treg細胞低甲基化DMRs和高可及性峰中，bZIP轉錄因子（如BATF、Jun-AP1）的結合motifs中顯著富集。而bHLH轉錄因子（如c-Myc、n-Myc、USF1）motif僅富集于低甲基化DMRs，未在可及性峰值中富集。這些結果表明，bZIP因子可能在皮膚Treg細胞適應中同時受甲基化與可及性調控，而bHLH因子可能受甲基化調控進而發揮功能。

為驗證這些低甲基化位點功能，研究選取MLPH和GNA11位點的c-Myc結合位點，運用CRISPR激活系統（CRISPRa）進行靶向激活，結果顯示這兩個基因表達顯著上調，驗證了c-Myc結合位點低甲基化與鄰近基因（如MLPH、GNAI1）表達上調的相關性。這一功能實驗直接證明WGBS鑒定的低甲基化區域具有增強子活性，且其調控作用依賴于精確的甲基化狀態。