AAV-PCSK9（包裝PCSK9腺相關病毒）動脈粥樣硬化造模方法

AAV-PCSK9造模方法
利用小鼠構建動脈粥樣硬化的模型，通常用如下方法：包裝PCSK9腺相關病毒 (rAAV-D377Y-mPCSK9/ rAAV-D374Y-hPCSK9) ， 通過 靜脈注射 的方法，將 2-5×10E11vg病毒 注射至8周齡左右的小鼠體內，然后 高脂飲食喂養12周后 進行取材檢測。

客戶案例：
動脈粥樣硬化相關疾病致死率高，由功能失調的脂質負載巨噬細胞（泡沫巨噬細胞）引發。目前調控泡沫巨噬細胞形成的關鍵調節因子尚未明確，已知芳香烴受體相互作用蛋白（AIP）可抑制巨噬細胞膽固醇酯積累，可能抑制動脈粥樣硬化泡沫巨噬細胞的生成，但對AIP及其他關鍵基因相關的基因網絡分析較少，亟待深入研究以明確泡沫巨噬細胞形成的關鍵調控機制。
2025年3月23日，重慶醫科大學附屬第二醫院孫陽教授團隊在Advanced Science (IF14.1)發表題為“Macrophage HM13/SPP Enhances Foamy Macrophage Formation and Atherogenesis”的論文。研究發現AIP下調巨噬細胞HM13/SPP，HM13/SPP促進泡沫巨噬細胞生成和動脈粥樣硬化形成，為防治動脈粥樣硬化提供了潛在靶點。

· 維真助力·
病毒產品：AAV8-PCSK9D377Y
實驗動物：Hm13fl/fl 、Hm13mKO 及Hm13mOE 小鼠
注射方式：尾靜脈單次注射
病毒用量：6×10^11 viral particles
造模方法：注射病毒后，標準飼料喂養下恢復7天，隨后西方飲食喂養12周

研究結果
1. AIP與AHR的相互作用抑制HM13轉錄激活，從而抑制巨噬細胞脂質積聚
研究團隊通過對人類動脈粥樣硬化斑塊轉錄組數據進行WGCNA分析及候選基因篩選，發現ERAD蛋白酶基因HM13在STAGE動脈粥樣硬化斑塊隊列中顯著上調；通過分析scRNAseq數據集，確定AIP和HM13在泡沫巨噬細胞中均有較高表達，且呈顯著負相關。體外實驗中，oxLDL處理可下調巨噬細胞AIP mRNA和蛋白表達，上調HM13/SPP mRNA和蛋白表達。對人冠狀動脈粥樣硬化斑塊和匹配的正常冠狀動脈樣本分析發現，冠狀動脈斑塊中 CD45+CD68+巨噬細胞和泡沫巨噬細胞百分比顯著高于正常樣本，且AIP與HM13在冠狀動脈斑塊泡沫巨噬細胞中呈顯著負相關，在人頸動脈斑塊泡沫巨噬細胞中也得到了蛋白水平的驗證。鑒于AIP與HM13/SPP表達呈負相關，研究人員假設AIP可能下調巨噬細胞中HM13/SPP的表達，且該過程可能通過抑制p38-c-JUN信號通路實現。在hMDMs 和mBMDMs中過表達WT AIP（AIP-WT）或AIP突變體（AIPΔCT）并暴露于oxLDL 24 小時。結果顯示，AIP-WT可抑制p38 和c-JUN的磷酸化，下調HM13 mRNA和蛋白表達，減少oxLDL處理細胞中總膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯的積累；而AIPΔCT無此作用。

2. 髓系HM13/SPP在兩種高脂血癥動脈粥樣硬化小鼠模型中增加斑塊負荷和泡沫巨噬細胞負荷
數據表明巨噬細胞HM13/SPP增強了oxLDL誘導的泡沫巨噬細胞的形成和促炎特性。研究團隊進一步利用兩種高脂血癥動脈粥樣硬化小鼠模型，探究髓系HM13/SPP對斑塊負擔和泡沫巨噬細胞負載的影響。在骨髓移植模型中，ApoE−/−Hm13mKO嵌合體小鼠主動脈粥樣硬化程度減輕，主動脈竇病變和壞死核心、 泡沫巨噬細胞負載和總體Mac3+免疫反應面積均較小，而ApoE−/−Hm13mOE嵌合體小鼠則與之相反。

在注射AAV8-Pcsk9誘導的模型中，Hm13mKO rAAV8-Pcsk9小鼠主動脈粥樣硬化程度減輕，主動脈竇病變和壞死核心以及泡沫巨噬細胞尺寸較小，在Hm13mOE rAAV8-Pcsk9小鼠中則表現相反。

3. 巨噬細胞HM13/SPP通過HO-1降解促進泡沫巨噬細胞形成和動脈粥樣硬化
免疫共沉淀實驗表明，HM13/SPP能與HO-1結合，且其催化活性可降低HO-1蛋白表達。在THP-1巨噬細胞中進行的脈沖追蹤分析顯示，具有催化活性的HM13/SPP可切割HO-1。通過環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗發現，Hm13mOE 可促進hemin刺激的mBMDMs中HO-1的降解，Hm13mKo 則抑制該過程；在hMDMs中，抑制HM13/SPP也可抑制HO-1的降解。用蛋白酶體抑制劑環氧霉素預處理可消除Hm13mOE 對HO-1降解的促進作用，而溶酶體途徑抑制劑氯喹則無此效果，表明 HM13/SPP介導的HO-1切割是其蛋白酶體降解所必需的。進一步的分析表明RNF139和DERLIN-1是HM13/SPP介導的HO-1切割和后續降解所必需的。隨后的研究發現巨噬細胞HM13/SPP通過促進HO-1降解，下調膽固醇流出轉運蛋白表達，影響脂質積累和炎癥因子釋放，進而在細胞、動物和人體樣本層面促進泡沫巨噬細胞形成和動脈粥樣硬化進程。

研究結論
本研究揭示AIP與AHR的相互作用下調了巨噬細胞HM13/SPP，后者是oxLDL誘導的脂質積聚、泡沫巨噬細胞生成和動脈粥樣硬化形成的驅動因素。因此，靶向巨噬細胞AIP-HM13/SPP軸的療法或可對抗泡沫巨噬細胞的形成，但對動脈粥樣硬化斑塊消退和穩定性的影響需進一步研究。