基因編輯技術的原理及其在基因篩查、動物細胞模型構建等中的應用

同源重組技術（homologous recombination，HR）是較早使用的基因編輯技術，其原理是將外源性目的基因導入受體細胞，通過同源序列交換，使外源性 DNA 片段取代原位點上的基因，從而達到使特定基因失活或修復缺陷基因的目的。由于 HR 效率極低，且出錯率高，因此其應用受到了一定的限制。

20 世紀 80 年代末、90 年代初，人們發現通過在特定的基因組靶點誘導雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB），能在染色體水平上實現高效和準確的基因修飾。DSB 被誘導后，細胞內將啟動兩種主要的修復機制：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修復（homology directed repair，HDR）。NHEJ 不依賴模板直接連接 DNA 兩端，可以在 DSB 位點有效產生不同長度片段的插入或缺失，通常導致基因功能失活；而在 HDR 中，斷裂鏈依賴于模板進行定向修復，可以實現特定位點的精確插入、缺失或者堿基置換。
 

此后，科學家便專注于開發各種基于核酸內切酶機制的基因編輯技術，以實現對特定基因組位點 DSB的精確誘導。

主要基因編輯技術及原理 1. 鋅指核酸酶（ZFN）

• 結構：由 “鋅指蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
• 原理：
  • 鋅指蛋白通過識別特定的 DNA 堿基序列（每 3 個堿基對應一個鋅指結構），精準結合到目標基因位置。
  • 兩個 ZFN 分子分別結合到目標序列的兩側，FokI 核酸酶在二聚化后發揮活性，切斷雙鏈 DNA。
  • 細胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）修復斷裂的 DNA，從而實現基因的插入、刪除或替換。

2. 轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）

• 結構：由 “TALE 蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
• 原理：
  • TALE 蛋白的識別單元由 34 個氨基酸組成，其中第 12 和 13 位氨基酸（重復可變雙殘基，RVD）決定其識別的堿基（如 NI 識別 A，NG 識別 T 等），通過串聯不同 RVD 的單元，可精準識別任意 DNA 序列。
  • 與 ZFN 類似，兩個 TALEN 分子分別結合目標序列兩側，FokI 二聚化后切割 DNA，再通過細胞修復機制實現基因編輯。

3. CRISPR-Cas 系統（目前應用最廣泛）

• 核心組成：CRISPR（成簇規律間隔短回文重復序列）和 Cas（CRISPR 相關蛋白，如 Cas9）。
• 原理：
  • 識別階段：人工設計的 sgRNA（單引導 RNA）通過堿基互補配對，精準結合到目標 DNA 序列，同時引導 Cas9 蛋白定位到該位置。
  • 切割階段：Cas9 蛋白具有核酸酶活性，可在 sgRNA 結合的位置切斷雙鏈 DNA，產生平末端斷裂。
  • 修復階段：
    • 非同源末端連接（NHEJ）：細胞快速修復斷裂，但容易引入堿基的插入或缺失，導致基因功能失活（常用於敲除基因）。
    • 同源重組（HDR）：若提供含目標序列的同源模板，細胞會以模板為參照修復 DNA，實現基因的精準插入或替換（常用於基因敲入）。