AAV-cTNT尾靜脈注射小鼠心臟的病毒用量的研究
心力衰竭（HF）是全球主要死因之一，目前治療手段有限。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）在心臟的正常和病理信號傳導(dǎo)中起著重要作用。PDE4是心臟中降解cAMP的主要磷酸二酯酶，PDE4的4B和4D亞型在心臟功能調(diào)節(jié)中的作用存在爭議。PDE4B過表達(dá)對心臟重塑和HF有益，然而，PDE4D和PDE4抑制劑在心力衰竭中的作用仍不明確。2025年2月22日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院付琴教授團(tuán)隊(duì)在Redox Biology (IF10.7) 發(fā)文“PDE4D inhibition ameliorates cardiac hypertrophy and heart failure by activating mitophagy”。該研究發(fā)現(xiàn) PDE4D 在心力衰竭中表達(dá)增加，抑制PDE4D可通過激活線粒體自噬改善心肌肥厚和心力衰竭，為心力衰竭治療提供新靶點(diǎn)和策略。
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基因信息：PDE4D5：磷酸二酯酶4D變體
實(shí)驗(yàn)動物：PDE4D+/−及WT小鼠
病毒產(chǎn)品：AAV9-cTNT-PDE4D5、AAV9-NC
注射方式：尾靜脈注射
病毒用量：5.0x10^11vg/mouse
基因信息：PDE4D5：磷酸二酯酶4D變體
實(shí)驗(yàn)動物：PDE4D+/−及WT小鼠
病毒產(chǎn)品：AAV9-cTNT-PDE4D5、AAV9-NC
注射方式：尾靜脈注射
病毒用量：5.0x10^11vg/mouse
免疫熒光染色檢測PDE4D在心肌細(xì)胞中特異性過表達(dá)
研究結(jié)果
1、PDE4D誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和氧化應(yīng)激
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示使用PDE4抑制劑羅氟司特可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大和心力衰竭，同時ISO處理使小鼠心臟PDE4D mRNA和蛋白水平上調(diào)，并降低PKA 活性；羅氟司特處理可抑制PDE4D的誘導(dǎo)，使PDE4活性、cAMP含量以及CREB和受磷蛋白的磷酸化水平恢復(fù)正常，且對PDE4A和PDE4B的表達(dá)無顯著影響。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PDE4抑制劑的心臟保護(hù)作用，通過對比PDE4D 和PDE4B對心肌細(xì)胞的不同影響，發(fā)現(xiàn)PDE4D可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和氧化應(yīng)激，而PDE4B無此作用。與非衰竭心臟相比，衰竭人類心臟中PDE4D蛋白表達(dá)升高，其中 PDE4D5 變體表達(dá)顯著增加。通過在NRVMs中過表達(dá)PDE4D5，發(fā)現(xiàn)PDE4D5可能參與心臟肥大和線粒體損傷的病理過程。進(jìn)一步研究證實(shí)PDE4D5過表達(dá)會抑制心肌細(xì)胞中PINK1和Parkin的蛋白表達(dá)，降低LC3BII/I比值，增加P62表達(dá)，而PDE4B過表達(dá)對上述指標(biāo)無明顯影響，綜合說明線粒體自噬受損與PDE4D誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和線粒體損傷有關(guān)。
1、PDE4D誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和氧化應(yīng)激
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示使用PDE4抑制劑羅氟司特可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大和心力衰竭，同時ISO處理使小鼠心臟PDE4D mRNA和蛋白水平上調(diào)，并降低PKA 活性；羅氟司特處理可抑制PDE4D的誘導(dǎo)，使PDE4活性、cAMP含量以及CREB和受磷蛋白的磷酸化水平恢復(fù)正常，且對PDE4A和PDE4B的表達(dá)無顯著影響。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PDE4抑制劑的心臟保護(hù)作用，通過對比PDE4D 和PDE4B對心肌細(xì)胞的不同影響，發(fā)現(xiàn)PDE4D可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和氧化應(yīng)激，而PDE4B無此作用。與非衰竭心臟相比，衰竭人類心臟中PDE4D蛋白表達(dá)升高，其中 PDE4D5 變體表達(dá)顯著增加。通過在NRVMs中過表達(dá)PDE4D5，發(fā)現(xiàn)PDE4D5可能參與心臟肥大和線粒體損傷的病理過程。進(jìn)一步研究證實(shí)PDE4D5過表達(dá)會抑制心肌細(xì)胞中PINK1和Parkin的蛋白表達(dá)，降低LC3BII/I比值，增加P62表達(dá)，而PDE4B過表達(dá)對上述指標(biāo)無明顯影響，綜合說明線粒體自噬受損與PDE4D誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和線粒體損傷有關(guān)。
PDE4D，而不是PDE4B，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和氧化應(yīng)激
2、PDE4抑制劑通過SIRT1/PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)線粒體自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞免受肥大和氧化應(yīng)激
使用siRNA敲低PINK1表達(dá)后，羅氟司特誘導(dǎo)的PINK1和Parkin表達(dá)增加被消除，其對ISO處理的NRVMs 細(xì)胞大小、氧化應(yīng)激和線粒體損傷的保護(hù)作用也被阻斷，且抑制了羅氟司特誘導(dǎo)的Parkin和LC3B與線粒體的共定位。SIRT1可通過改善PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬保護(hù)線粒體。ISO處理顯著降低心肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，羅氟司特可減弱這一降低。用SIRT1 shRNA處理后，羅氟司特對ISO誘導(dǎo)的心臟肥大、氧化應(yīng)激和線粒體損傷的保護(hù)作用被消除，其誘導(dǎo)的PINK1、Parkin和LC3B與線粒體的共定位也減弱，表明PDE4抑制劑通過激活SIRT1介導(dǎo)的PINK1/Parkin 信號通路誘導(dǎo)線粒體自噬，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。進(jìn)一步研究表明PDE4 抑制劑可減輕TAC誘導(dǎo)的心臟肥大和心力衰竭，主要通過促進(jìn)心臟線粒體自噬實(shí)現(xiàn)。
使用siRNA敲低PINK1表達(dá)后，羅氟司特誘導(dǎo)的PINK1和Parkin表達(dá)增加被消除，其對ISO處理的NRVMs 細(xì)胞大小、氧化應(yīng)激和線粒體損傷的保護(hù)作用也被阻斷，且抑制了羅氟司特誘導(dǎo)的Parkin和LC3B與線粒體的共定位。SIRT1可通過改善PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬保護(hù)線粒體。ISO處理顯著降低心肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，羅氟司特可減弱這一降低。用SIRT1 shRNA處理后，羅氟司特對ISO誘導(dǎo)的心臟肥大、氧化應(yīng)激和線粒體損傷的保護(hù)作用被消除，其誘導(dǎo)的PINK1、Parkin和LC3B與線粒體的共定位也減弱，表明PDE4抑制劑通過激活SIRT1介導(dǎo)的PINK1/Parkin 信號通路誘導(dǎo)線粒體自噬，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。進(jìn)一步研究表明PDE4 抑制劑可減輕TAC誘導(dǎo)的心臟肥大和心力衰竭，主要通過促進(jìn)心臟線粒體自噬實(shí)現(xiàn)。
PDE4抑制劑通過SIRT1激活誘導(dǎo)線粒體自噬，防止心肌細(xì)胞肥大和線粒體功能障礙
3、PDE4D5的心臟過表達(dá)抵消了PDE4D敲除對TAC小鼠的心臟保護(hù)作用
選用他莫昔芬誘導(dǎo)的心臟特異性雜合PDE4D敲除（PDE4DhCKO ）小鼠，進(jìn)行TAC手術(shù)及他莫昔芬處理，通過評估心臟功能、細(xì)胞狀態(tài)及線粒體自噬情況，證實(shí)下調(diào)PDE4D對TAC誘導(dǎo)的心臟肥大和心力衰竭有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究PDE4D5在體內(nèi)病理性心肌肥大和心力衰竭中的作用，研究團(tuán)隊(duì)使用雜合PDE4D基因敲除小鼠（PDE4D+/-），通過靜脈注射攜帶PDE4D5的AAV9載體，使心臟特異性過表達(dá)PDE4D5，這一操作加劇了TAC小鼠的心臟肥大和收縮功能障礙，同時惡化了細(xì)胞凋亡、ROS水平和MDA含量，還降低了線粒體嵴評分、線粒體自噬體形成和ATP含量。此外，PDE4D5 過表達(dá)抵消了PDE4D+/−小鼠因PDE4D基因敲除所產(chǎn)生的保護(hù)效果，表明PDE4D5在促進(jìn)心臟肥大和心力衰竭中起到關(guān)鍵作用，它主要通過抑制線粒體自噬來實(shí)現(xiàn)這一過程
選用他莫昔芬誘導(dǎo)的心臟特異性雜合PDE4D敲除（PDE4DhCKO ）小鼠，進(jìn)行TAC手術(shù)及他莫昔芬處理，通過評估心臟功能、細(xì)胞狀態(tài)及線粒體自噬情況，證實(shí)下調(diào)PDE4D對TAC誘導(dǎo)的心臟肥大和心力衰竭有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究PDE4D5在體內(nèi)病理性心肌肥大和心力衰竭中的作用，研究團(tuán)隊(duì)使用雜合PDE4D基因敲除小鼠（PDE4D+/-），通過靜脈注射攜帶PDE4D5的AAV9載體，使心臟特異性過表達(dá)PDE4D5，這一操作加劇了TAC小鼠的心臟肥大和收縮功能障礙，同時惡化了細(xì)胞凋亡、ROS水平和MDA含量，還降低了線粒體嵴評分、線粒體自噬體形成和ATP含量。此外，PDE4D5 過表達(dá)抵消了PDE4D+/−小鼠因PDE4D基因敲除所產(chǎn)生的保護(hù)效果，表明PDE4D5在促進(jìn)心臟肥大和心力衰竭中起到關(guān)鍵作用，它主要通過抑制線粒體自噬來實(shí)現(xiàn)這一過程
PDE4D5的心臟過表達(dá)抵消了PDE4D敲除對TAC小鼠的心臟保護(hù)作用
研究結(jié)論
本研究闡明持續(xù)腎上腺素能激活通過cAMP-PKA信號上調(diào)PDE4D表達(dá)，抑制 CREB-SIRT1信號介導(dǎo)的線粒體自噬，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和線粒體損傷。強(qiáng)調(diào)抑制PDE4D表達(dá)可能是治療HF的一種新策略。
本研究闡明持續(xù)腎上腺素能激活通過cAMP-PKA信號上調(diào)PDE4D表達(dá)，抑制 CREB-SIRT1信號介導(dǎo)的線粒體自噬，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和線粒體損傷。強(qiáng)調(diào)抑制PDE4D表達(dá)可能是治療HF的一種新策略。
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