生物制藥領域支原體檢測的主流方法

在生物制藥領域，支原體污染可能影響產品安全性和有效性，因此檢測方法需具備高靈敏度、特異性和可靠性。目前該領域支原體檢測的主流方法如下：
 
一、核酸擴增法（NAT-PCR ）
原理：通過設計針對支原體保守基因的特異性引物，利用 PCR 或實時熒光定量 PCR（qPCR）技術擴增樣本中的支原體核酸，通過熒光信號或電泳結果判斷是否存在污染。
特點（qPCR法）：
靈敏度高：配合抽提方案，可檢測低至 10¹ CFU/mL 的支原體。
速度快：2-4 小時內可出結果，優于傳統培養法。
特異性強：引物針對支原體特有序列，減少其他微生物干擾。
適用范圍廣：可檢測細胞培養上清、發酵液、純化產物等多種樣本類型。
應用場景：生物制藥生產過程中的中間產物，以及細胞庫、培養基的常規監控。
二、支原體培養法（經典金標準）
原理：將樣本接種于含血清、酵母提取物等營養成分的特殊培養基（如 Hayflick 培養基、PPLO 培養基）中，在適宜溫度（35-37℃）和氣體環境下培養，觀察是否出現典型的 “油煎蛋” 狀菌落。
特點：
準確性高：可直接培養并鑒定活支原體，是藥典（如《中國藥典》3301 支原體檢查法）規定的參考方法。
可進行藥敏試驗：若培養陽性，可進一步測試抗生素敏感性，指導污染處理。
缺點：培養周期長（需 21 天以上），操作復雜，對實驗室環境和技術要求高。
應用場景：用于法規要求的最終產品放行檢測。
三、指示細胞法
原理：是一種通過觀察特定細胞（指示細胞）在支原體污染后的形態或功能變化，來間接檢測支原體的方法。
特點：
直觀性：通過細胞形態或代謝變化直接反映支原體感染，無需復雜儀器，適合基層實驗室。
模擬生理環境：指示細胞與支原體的相互作用更接近實際感染場景，可檢測部分難以用核酸或培養法發現的苛養型支原體。
缺點：需較高濃度的支原體（10⁴-10⁵ CFU/mL）才能觀察到明顯變化，易漏檢早期或低水平污染；耗時較長，共培養需 3-7 天；特異性差，結果判斷易受人為因素影響。
應用場景：初步篩查，在缺乏 PCR 設備的實驗室中，作為支原體污染的初篩手段，尤其是細胞培養過程中的日常監控。
 
幾種方法的對比

檢測方法	靈敏度	檢測時間	特異性	操作復雜度	法規符合性
指示細胞法	低	3-7 天	低	低	非藥典主流方法
培養法	中	21 天以上	高	高	藥典金標準
核酸擴增法（qPCR 法）	高	2-4 小時	高	中	藥典可選：經過驗證后，可以選用