金標準細胞計數方法使用血細胞計數板人工計數的詳細步驟與注意事項

細胞計數是細胞培養過程中的重要步驟，“金標準細胞計數方法”是在顯微鏡下使用血細胞計數板人工計數。這里博大博聚為大家介紹下金標準細胞計數的詳細的步驟，供大家參考。

1、準備好血細胞計數板
1)     先用無水乙醇清潔血細胞計數板表面和蓋玻片；
2)     再用純水清潔血細胞計數板表面和蓋玻片；
3)     每次清洗后用洗耳球吹干。
4)     在血細胞計數板的計數池上方蓋上專用的蓋玻片。
注意：最好不要擦拭血細胞計數板的計數池，防止標識線損壞。

2、制備細胞懸液
1)     貼壁生長的細胞，使用胰酶消化的方法使細胞從培養瓶表面脫落；
2)     漩渦混勻或使用移液器反復吹吸細胞懸液，盡量減少細胞團簇；
3)     懸浮細胞則可以直接進行取樣計數；
4)     細胞懸液的計數濃度：5×10⁵個細胞/m L -5×10⁶個細胞/m L。

注意：
a)      盡量少、盡量小的細胞團簇；
b)     如需計算活率，則需將細胞懸液按照1：1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料，混勻后，靜置1~2分鐘。   

3、細胞加樣
1)     移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻；
2)     將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻；
3)     取出10uL細胞懸液，將細胞懸液滴加于血細胞計數板邊緣凹槽處，此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池。
 

注意：                                             
1)     每次加樣前要混勻細胞懸液，防止細胞沉降造成取樣誤差增大；
2)     加樣過程中，要一次性將細胞懸液注入計數室，防止氣泡產生，否則要重做；
3)     加樣時不要將細胞懸液直接吹入計數池，會造成細胞分布不均勻。

4、 人工細胞計數
計數工具：10X物鏡的顯微鏡、血細胞計數板。
1)     加樣后，將血細胞計數板靜置數分鐘；
2)     把血細胞計數板放置在顯微鏡的載物臺進行觀察-計數-記錄；
3)     分別計數大方格1-2-3-4中的細胞總數。
 

注意：
1)     計數時建議重復1-2次，取平均值，減小計數誤差；
2)     四個區域的細胞數量偏差不應超過 5%，否則要重新加樣。
3)     對橫跨刻度上的細胞，依照“數上不數下，數左不數右”的原則進行計數。
4)     為降低細胞計數誤差，濃度最好控制在5×10⁵個細胞/ml以上（每個大方格有50個以上細胞）；
5)     計數時，只計數完整的細胞，如有聚團細胞則按一個細胞進行計數。

5、 血細胞計數板濃度計數標準
（中國的標準：JJG 552-1988血細胞計數板試行檢定規程）
 

1)     如上圖所示，當血細胞計數板放上蓋玻片后，平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm；
2)     平臺中心部分各以3mm長，3mm寬精確劃分為9個大方格，稱為計數室，每個大方格面積為1mm²，體積為 0.1mm³；
3)     細胞濃度 (mL)=(四個大方格細胞數之和)/4X2（染液稀釋倍數）X 10⁴⁼？個細胞/mL。

注意：如果不加入臺盼藍染料，則無需乘以2。
相信有些小伙伴，即使花費很長時間熟悉，并實際接觸細胞計數操作的全部流程后，還是會有結果不滿意、人工操作效率低、結果無法一目了然、細胞計數數到“眼疼”的情況。

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7、血細胞計數板上機實拍圖案例

8、細胞計數結果包括
總細胞濃度、活/死細胞濃度、活/死細胞比率、總細胞聚團率/濃度、活細胞聚團率/濃度、死細胞聚團率/濃度等計數結果、原始圖片、識別圖片、柱狀圖、散點圖、等高線圖、報告單等…

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