蛋白質組學常見問題及解答

隨著“人類蛋白質組計劃”的提出，越來越多的科研人員將關注力放在蛋白質組學上，蛋白質是生命活動功能的執行者，從蛋白質的角度去研究生命的活動已經成為大生命科學領域研究的重要分支。關于蛋白質組學檢測，很多老師、同學有或多或少的疑問，那么小編將大家經常咨詢的問題匯總一下，供各位老師、同學參考。

Q1：什么樣本能做蛋白組學檢測？大概可以測到多少的蛋白種類？

A:原則上只要能提取到蛋白，就可以做蛋白組檢測。樣本測到的蛋白種類跟數據庫和樣本本身蛋白濃度有關，一般數據庫越大，可以鑒定到的蛋白質數量越多。也與樣本的類型有關，通常，組織細胞相比于體液樣本，能夠鑒定到更多的蛋白。

Q2：蛋白組學樣本寄送前是否需要精確計數或是稱量？

A:不同樣本寄送會有不同的送樣要求，按照收集方法提供可以保證實驗用量充足。不需要精確計數或是稱量，項目開展前會進行蛋白濃度的測定，后續也是不同樣本等蛋白量處理、上機檢測，但是要保證每個樣本的寄樣量達到實驗要求。

Q3：我的樣本不知道有沒有降解，量夠不夠？

A:常規蛋白組檢測項目，我們會進行蛋白濃度的測定，確定蛋白量是否夠用于后續的檢測。同時也會進行SDS-PAGE跑膠查看蛋白是否有降解，條帶是否明顯，如果蛋白量不夠或者膠條有異常，會及時跟客戶反饋，溝通解決方法。

Q4：哪些樣本需要去除高豐度蛋白？

A:血清、血漿、腦脊液等體液樣本，高豐度蛋白比例達到97%~99%，包括白蛋白、免疫球蛋白、IgG、IgA、抗胰蛋白酶、纖維蛋白原、轉鐵蛋白等。高豐度蛋白的存在會影響低豐度蛋白的檢測，而低豐度蛋白往往是比較關注的生物標記物或者藥物靶點，常規是建議去除高豐度蛋白再檢測。

Q5：膠條樣本如何送樣檢測？

A:可以切關注的部分條帶檢測，也可以單個樣本整個泳道進行檢測。如果是整個泳道檢測，建議至少分成兩份檢測，重輕鏈一份，其他一份，可以增加檢測深度。膠條的寄送采用冰袋運輸。

Q6：血清血漿樣本如何選擇？

A:都可以選擇使用，血漿含有纖維蛋白原，在血清中檢測到的蛋白的豐度相對于血漿來說更高一些，一些比較微量的蛋白可能血清可以檢測出。但是血清的操作步驟相對比血漿而言更復雜一些，可能會帶來人為誤差。

Q7：Label Free/TMT&iTRAQ/DIA產品如何選擇？

A:Label free和TMT&ITRAQ屬于數據依賴型采集模式（DDA），通常選擇TOP N個母離子肽段進行二級碎裂檢測，DIA產品屬于數據非依賴型的質譜采集方式，全部母離子都可以進入二級破碎，能夠定性到的蛋白數量可能會更多，依賴于建庫數據；

與標記蛋白組相比，DIA和label free均不會受限于樣本數量；與label free技術相比，DIA的可重復性更高。建議樣本數量比較大的時候選用此技術。樣本數量較小的時候，如果樣本之間差異比較大，需要查看蛋白的有無信息，推薦做label free產品。

如果樣本例數不多，想進行深度檢測，定性定量更準確，建議標記定量產品。

Q8：標記產品最多可以做多少樣本？

A:目前標記試劑盒主要分為TMT/iTRAQ兩種，試劑盒一次最多可以標記16個樣本，如果超過16例，可以通過搭橋樣本來實現批次間的校正。

Q9：物種如何選擇數據庫？

A:常規是使用uniprot網站該物種的蛋白數據庫作為搜庫文件，如果該物種的數據庫比較小或者沒有數據庫，可以選擇以下三種解決方案：（1）擴大物種的層級，選擇上一層級或是更大層級的物種庫；（2）選擇近源物種庫；（3）轉錄組測序結果作為數據庫。有些個別的物種有專門的數據庫網站也可以采用去進行搜庫分析。

Q10:常規定量蛋白組實驗的主要步驟有哪些，主要采用哪些儀器檢測？數據分析內容包含哪些？

A:實驗步驟：首先獲得生物學樣本，然后進行蛋白提取，定量，SDS-PAGE跑膠質控，還原烷基化，酶解，獲得肽段，（標記+分組分），上機檢測，搜庫軟件搜庫，數據分析；

儀器：主要采用Q Exactive™ HF-X 、Orbitrap Fusion™、Orbitrap Exploris™ 480等；

數據分析：主要分為基礎數據分析、⾼級數據分析和個性化數據分析三個部分。基礎分析主要包括差異表達蛋白篩選、層次聚類分析分析、COG注釋分析、亞細胞定位分析、GO注釋富集分析、KEGG注釋分析、PPI分析等。