大鼠原代細胞分離與培養

一、大鼠神經元細胞（酶消化法）
簡述：新生24h或E18胎鼠，取腦，剝離海馬，剪碎，木瓜酶消化，清洗過篩后鋪于多聚賴氨酸包被的培養板中。
二、大鼠雪旺細胞（植塊法）
簡述：新生24h大鼠，取坐骨神經，剝去外膜和束膜，剪成1mm³的小塊，均勻鋪于培養皿內，加少量血清，37℃ CO₂培養2h后，再加入培養基，24-48h后有細胞爬出。
三、大鼠胰島（酶消化加密度梯度離心）
簡述：SD大鼠，常規麻醉、固定、消毒、進腹、膽總管插管，逆行注入預冷的１mg/ml膠原酶P溶液10ml。迅速取下胰腺，38℃水浴消化10分鐘，600μm不銹鋼網過濾，加入4℃新生牛血清和4℃Hank’s液終止消化。細胞懸液離心后，4℃ Hank’s液洗滌兩次。沉淀物加25%Ficoll混勻，其上依次分別加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank’s液，離心后吸出23%-20% 及20%-11%界面的胰島，用4℃Hank’s液洗滌離心共三次。
四、大鼠心臟竇房結細胞（酶消化法）
簡述：大鼠心臟竇房結位于上腔靜脈靠近右心房處的內壁上；取出生2-3day的新生大鼠，75%酒精浸泡后，固定于解剖板上，開胸，顯微剪分離出上腔靜脈及右心房一部，至于冷的HANKS緩沖液中，于解剖鏡下觀察搏動點，并剪去多余部分；之后將幾只鼠的竇房結集中，剪碎后用0.5mg/ml II型膠原酶37℃消化20-30分鐘，期間吹打數次，可分部收集消化下來的細胞。收集到的細胞加入10倍體積的PBS，1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復清洗一遍，沉淀中加入15%FBS的高糖DMEM培養基，重懸細胞，鋪板，37℃，5%CO₂ 培養90分鐘后，將未貼壁的細胞轉移至新的培養皿中，繼續培養，每天換液一次。
五、大鼠關節滑膜間質細胞（酶消化法）
簡述：大鼠麻醉后，75%酒精消毒術區，于雙側膝關節關節腔取出滑膜組織，浸泡于含1%鏈霉素和青霉素的雙抗H-DMEM中，低溫下轉移至超凈工作臺。使用含1 %雙抗的PBS沖洗滑膜組織3次，用眼科剪將其剪成約1 mm×1 mm大小的組織塊。加入10倍體積的0.4% Ⅰ型膠原酶，于37 ℃，體積分數5%CO₂飽和濕度條件下進行4 h消化，待絮狀物大部分消失后，100μm細胞篩過濾，吸取濾過液，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，無菌PBS洗滌3次，用含體積分數10%胎牛血清的H-DMEM高糖培養基(含200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗壞血酸，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)，以2×10⁶/孔的細胞濃度接種于六孔板中，置37 ℃，體積分數5%CO₂培養箱中培養。