貼壁細(xì)胞傳代的培養(yǎng)技巧

如何傳代貼壁細(xì)胞？

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細(xì)胞成單個細(xì)胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價離子的螯合劑，能抑制細(xì)胞膜上的Ca²⁺和Mg²⁺。常用的細(xì)胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca²⁺和Mg²⁺的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細(xì)胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ，觀察細(xì)胞直到細(xì)胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要5-15分鐘，為了避免細(xì)胞成團(tuán)，消化細(xì)胞的過程中不要拍打細(xì)胞瓶。對于特別難消化的細(xì)胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞置于37°C 促進(jìn)消化，細(xì)胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培養(yǎng)基中止消化，血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。一般情況下，離心并不需要。如果細(xì)胞需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基，可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養(yǎng)基，加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞，移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，對于這種類型的細(xì)胞，可用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

傳代細(xì)胞的頻率多久較合適？

 傳代是指把細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶移到另一個培養(yǎng)瓶，傳代的間隔是指兩次傳代之間的時間。貼壁型的細(xì)胞的匯合度達(dá)到或者接近100%的時候，需進(jìn)行傳代操作，但是，有些細(xì)胞以克隆的形式生長，匯合度永遠(yuǎn)達(dá)不到100%，對于這種類型的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到或者接近最大密度的時候，就需傳代。接觸抑制型細(xì)胞（比如3T3）需要在細(xì)胞長滿之前傳代以避免產(chǎn)生細(xì)胞長滿后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。懸浮型的細(xì)胞必須在細(xì)胞達(dá)到最大飽和密度之前傳代，懸浮細(xì)胞傳代時只需稀釋至合適的密度，讓細(xì)胞有充足的營養(yǎng)恢復(fù)到對數(shù)生長期。如果僅僅是簡單的換液，而且細(xì)胞數(shù)量不減少，細(xì)胞將會快速耗盡營養(yǎng)而死亡；如果細(xì)胞稀釋到最低密度之下，細(xì)胞將會進(jìn)入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細(xì)胞的最大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的，所以，培養(yǎng)懸浮細(xì)胞要每日觀察。

胰酶消化傳代的濃度是多少？是否含EDTA？濃度？

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%，部分細(xì)胞由于貼壁較緊，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培養(yǎng)，胰酶的濃度需要做適當(dāng)?shù)奶岣摺?br />
細(xì)胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？

不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca²⁺, Mg²⁺和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 ℃ 其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
（2）0.25％胰蛋白酶＋0.03％EDTA。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液pH8.0~9.0；使用D-Hank液配制。 
多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。  

能否使用細(xì)胞說明書上不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞？

產(chǎn)品目錄或者細(xì)胞說明書上的推薦的培養(yǎng)基一般是細(xì)胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經(jīng)經(jīng)過驗證的對該細(xì)胞株最合適的培養(yǎng)基，細(xì)胞對未推薦的培養(yǎng)基也許會適應(yīng)，也有可能不適應(yīng)。對于更換培養(yǎng)基，應(yīng)謹(jǐn)慎對待，更換培養(yǎng)基時，應(yīng)留一瓶細(xì)胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，留作種子。更換培養(yǎng)基有兩種方法，最簡單的方法是直接更換培養(yǎng)基，強(qiáng)制使細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基；還有一種更溫和的方法：傳代細(xì)胞的時候分成細(xì)胞兩瓶，第一瓶使用原來推薦的培養(yǎng)基，第二瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，之后仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如果第二瓶細(xì)胞生長狀態(tài)不好，應(yīng)立即停止更換培養(yǎng)基，如果第二瓶生長狀態(tài)好，可以繼續(xù)傳代分瓶，一瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，另一瓶使用25%原來推薦的培養(yǎng)基，75%新的培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察，如果細(xì)胞狀態(tài)好，可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。
 
PS:
培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，如何更換培養(yǎng)基？
如果空間足夠，只需添加適量的新鮮培養(yǎng)基，這是培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時更換培養(yǎng)基首選的方法（少數(shù)細(xì)胞除外）；也可以通過離心（1000g / 5min）去除舊的培養(yǎng)基后，用新鮮的培養(yǎng)基輕輕地重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶。