知識分享：細胞傳代、培養的方法

實驗原理：

將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時 也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

實驗儀器

培養箱（調整至37℃）、培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱（37℃）

實驗試劑：

 1640培養基或DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank′s液、碘酒、75%酒精

實驗步驟：

一、原代細胞培養步驟

1、準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

3、處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30-60分鐘。

4、剪切：用眼科剪把組織切成2-3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30-50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

5、消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

6、分離：在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500-1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。

7、計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來說，pH要求在7.2-7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調整。

8、培養：置于37℃溫箱培養，如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。

二、原代組織塊培養法

1、剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm塊為止。

2、擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養瓶底可擺布20-30塊。

3、輕輕翻轉培養瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置37℃溫箱培養2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。

4、培養：從微箱中取出培養瓶，開塞，46度斜持培養瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養液少許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過來，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。

三、貼壁細胞傳代的操作步驟：

1、吸除培養瓶內舊培養液。

2、向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

3、置溫箱中2-5分鐘，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

4、吸除消化液，向瓶內注入Hanks液數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液。

5、用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

6、計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養。

四、懸浮型細胞傳代

1、吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

2、吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

注意事項

1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

5、瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。

6、 吸溶液的吸管等不能混用。

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