知識分享：基因定點突變
實驗原理
基因定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法改變目的基因的序列，包括堿基的插入、缺失、點突變等。基因定點突變是基因研究中比較常用的方法，可以短時間內研究目的DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征。
定點突變需要設計特定的突變引物。引物長度一般為25-45 bp，建議選擇30-35bp長度的引物p。引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求引物兩邊都能與模板搭上，所以引物的兩邊各設至少12個bp。以要突變的位點堿基為中心，加上兩邊11-12 bp的序列。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗。同時需要設計一條反向互補的引物。為保證PCR反應正常進行，引物設計完成后需計算Tm值，若Tm值不合適，可以適量調整引物長度。
實驗材料
PCR引物，質粒或者基因組模板，PCR Buffer，PCR用高保真酶，ddH2O。
實驗過程
1、PCR擴增
30 μL PCR（phusion）體系如下：
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成分 |
體積（ul） |
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水 |
18.2 |
|
Buffer |
6 |
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DMSO |
0.9 |
|
dNTP |
0.6 |
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酶 |
0.3 |
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引物F+R |
1.5+1.501 |
|
DNA模板 |
|
2、膠回收
第一輪PCR產物需要進行膠回收后再進行二輪PCR。
將第一輪PCR得到的條帶進行切膠回收后，作為模板進行二輪PCR，二輪PCR的引物已第一輪PCR所用的兩端引物。二輪PCR反應結束后需要進行純化回收，為下一步的酶切做準備。
3、酶切
通過酶切回收目的基因片段、載體時，避開基因中的酶切位點，選擇合適限制性內切酶。當酶切回收目的基因時要注意目的基因裝在PENTER載體的位置。用限制性內切酶處理目的載體時，要將載體片段的量控制在2μg以內，并在酶切反應后進行去磷酸化處理。
30μL酶切體系
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成分 |
體積（ul） |
|
載體DNA |
1-2ug |
|
10X Buffer |
1 |
|
E1 |
0.8 |
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E2 |
0.8 |
|
水 |
補足30ul |
4、連接
根據片段的大小以及基因的亮度來調節片段連接的比例，一般亞克隆的連接體系如下
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成分 |
體積（ul） |
|
載體DNA |
2 |
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目的基因 |
6 |
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T4連接酶 |
1 |
|
T4 Buffer |
1 |
將連接產物放于22℃保持1~2h。
5、轉化
（1）冰上融化感受態DH5a,，加1ug/ul的質粒1ul于10ul感受態中，冰上放置30min。
（2）42℃水浴鍋中熱休克90s，迅速轉移至冰上2min-5mins。
（3）超凈臺內向各管含質粒的感受態中加入500ul-1ml高壓過的LB培養基，37℃，低速培養1h。
（4）取100ul轉化菌涂板，至菌液快干時，倒置于37℃恒溫孵箱中培養12-16小時，次日觀察菌落生長情況。
6、獲取正確質粒
（1）挑取轉化子
挑去大腸桿菌轉化子至正確的抗性培養基中（KANA、AMP）,并對HM號及孔號做好記錄。
（2）酶切驗證
將提取好的質粒用合適的限制性內切酶進行酶切驗證。
10μL酶切驗證體系：
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成分 |
體積（ul） |
|
質粒DNA |
3 |
|
10X Buffer |
1 |
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E1 |
0.25 |
|
E2 |
0.25 |
|
水 |
5.5 |
37℃保持30min~1h后進行瓊脂糖凝膠電泳。
（3）測序
將酶切驗證正確的樣品送至測序公司進行測序，并做好記錄。
注意事項
1、引物設計時須參照引物設計原則，注意引物中的GC含量，引物長度等，可在引物的兩端選擇G或者C，可以提高引物和模板結合的概率。
2、PCR過程中未得到相應大小條帶或條帶不單一，應適當調整退火溫度，已調整聚合酶和引物的特異性。
3、使用一輪PCR產物進行第二輪PCR時，需等量加入作為模板的PCR產物的mol量。
4、某些特殊的限制性酶切酶處理基因時需要進行65℃滅酶處理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使內切酶變性和DNA分離。
5、連接后轉化，注意載體中的抗性基因，可以設置空白對照，已轉化后得到的單菌落數量評估獲取陽性克隆的概率。
6、酶切驗證后，正確克隆須送測序驗證，使用軟件比對序列的堿基是否已經完成突變。
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