知識分享：光遺傳學技術

光遺傳學（optogenetics）又稱光刺激基因工程（optical stimulation plus genetic engineering），是一種通過光學和遺傳學技術在活體動物腦內精準控制細胞行為的技術。由于其高度的時空特異性，光遺傳技術廣泛應用于神經(jīng)科學領域的研究。

      2010年，光遺傳學技術榮膺Nature Methods 年度生命科學技術。 2010年，被Science認為是近十年的突破之一。 光遺傳學技術再次被Nature Methods評為2016年最值得關注的八項技術之一。 未來，光遺傳技術將對神經(jīng)及精神領域疾病的治療及神經(jīng)科學以外的組織功能研究貢獻更多力量。

 

一． 光遺傳學之前

 

      1979年，F(xiàn)rancis Crick提出，神經(jīng)科學領域急需開發(fā)出一種控制技術，進而在不改變其它條件的情況下對大腦里的某種細胞進行操控。由于電刺激信號（electrode）無法對細胞進行精確的定位刺激，而化學藥物起效速度慢，無法精確定時控制，于是Crick考慮是否可以利用光控技術。雖然微生物學家們早已發(fā)現(xiàn)一些可以表達可見光敏蛋白（visible light-gated protein），但當時還沒人將此聯(lián)系在一起。

 

                圖1. 光遺傳學出現(xiàn)之前神經(jīng)科學領域的主要研究技術

 

二．光遺傳學

 

1.光遺傳學的發(fā)展歷程

      

      2005年8月Karl Deisseroth實驗室發(fā)表的一篇文章為神經(jīng)領域的科學家們帶來了一項期待已久的新技術——光遺傳學技術。這項技術的實現(xiàn)基于單組分控制工具——光敏蛋白的發(fā)現(xiàn)。

                                           圖2. 光遺傳學的發(fā)展歷程

 

2．光遺傳學原理

      

      在神經(jīng)元細胞中，細胞膜去極化后會出現(xiàn)動作電位。反之，細胞膜超極化則會抑制峰電位的出現(xiàn)。在神經(jīng)元細胞中表達可以改變膜電位的外源性光敏蛋白編碼基因，就能夠通過光控操作來控制峰電位開關。

 

                                     圖3. 神經(jīng)元的靜息電位和動作電位

 

       這類微生物編碼的視蛋白神經(jīng)元細胞開關中第一個被使用的就是ChR2（channelrhodopsin-2）。作為一種非選擇性陽離子通道蛋白，在神經(jīng)元中表達的ChR2在藍光照射下會立即使神經(jīng)元發(fā)生去極化反應，誘發(fā)動作電位。

      不過，科學家不總是想要激活神經(jīng)元細胞。有一種名為NpHR的試驗菌視紫紅質蛋白（halorhodopsin）是一種氯離子泵，它所在的神經(jīng)元細胞被黃光照射之后會發(fā)生超級化反應，抑制動作電位的形成。

 

     圖4. 調控膜電位的光遺傳學工具——光敏通道蛋白

                          （Erika Pastrana，2011）

 

3. 光遺傳學所需的輔助技術及基本步驟

 

光遺傳學技術包括的范圍是廣泛的。主要包括以下幾種。

                                       圖5. 光遺傳學技術及其輔助技術

 

   在光遺傳操作中，細胞會表達特定的編碼光敏蛋白的基因，然后使用光來改變細胞的行為。光遺傳學控制細胞功能的基本步驟如下：

 

                                        圖6. 光遺傳學控制細胞功能的基本步驟

 

 

      其中，通過病毒感染將外源光敏蛋白的遺傳信息傳遞給靶細胞的方法是最方便快捷的。得益于腺相關病毒（adeno associated virus，AAV）對大腦特異的組織嗜性，使得AAV成為光遺傳研究中的重要工具。

 

4. 光遺傳學技術的優(yōu)勢——高時空分辨率

 

      光遺傳學技術在根本上解決了如何精確調控細胞行為的問題。這基于其具有高度時空特異性的優(yōu)勢。光遺傳學技術在時間上控制精度可達毫秒（ms）級別，空間精度可達單個細胞級別，是電信號刺激和化學藥物所無法比擬的。

                                             圖7. 光遺傳學的高時空分辨率

 

三、維真為您提供超多選擇的AAV光敏通道蛋白載體

 

      特定的啟動子和特定的AAV血清型，將為您的光敏遺傳實驗提供更精準的空間定位。維真為您提供24種啟動子、7種AAV血清型和5中光敏通道蛋白，超過840種載體組合。除此之外，還可根據(jù)您的需求定制光敏載體質粒。

      超多選擇成就您個性化的實驗需求！

                                               表1. 維真提供的AAV血清型

 

Cat.#	Promoter Name	Size	Description	Download
AP10001	ALB	2.4kb	Liver specific 10 timer stronger than CMV after 10 weeks	Vector Sequence
AP10002	GFAP104	845bp	Hybrid of EF1a and GFAP	Vector Sequence
AP10003	CAG	944bp	Strong promoter, ubiquitous expression in vivo	Vector Sequence
AP10004	CamKIIa	1.2kb	Specific expression in excitatory neurons in the neocortex and hippocampus	Vector Sequence
AP10005	EF1A	1.2kb	Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo	Vector Sequence
AP10006	CK1.3	1.1kb		Vector Sequence
AP10007	CK0.4	217bp	Calcium/Calmodulin-dependent kinase II alpha	Vector Sequence
AP10008	GFAP	1.0kb	Specific in astrocyte	Vector Sequence
AP10009	MBP	1.3kb	Myelin basic protein promoter, efficient transduction of oligodendrocytes by adeno-associated virus type 8 vectors	Vector Sequence
AP10010	EFFS	253bp	A short version EF1A	Vector Sequence
AP10011	TBG	460bp	Homo sapiens serpin peptidase inhibitor, clade A	Vector Sequence
AP10012	aMHC	0.4kb	Mouse myosin heavy chain alpha promoter	Vector Sequence
AP10013	cTNT	702bp	Specifically transduce cardiomyocytes	Vector Sequence
AP10014	Synapsin	471bp	Specific in neuron	Vector Sequence
AP10015	Mecp2	230bp	Truncated Mcep2 neuron specific	Vector Sequence
AP10016	c-fos	1.7kb	Activity-dependent promoter	Vector Sequence
AP10017	ApoE/AAT1	1.4kb	Chimeric promoter of human alpha-1-antitrypsin and cer/hepatic locus control region (HCR). Liver specific.	Vector Sequence
AP10018	UBC	1.1kb	Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo	Vector Sequence
AP10019	PGK	400bp	Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo	Vector Sequence
AP10020	Somatostat	1.2kb	Restricting expression to GABAergic neuron	Vector Sequence
AP10021	Rpe65	700bb	Retinal Pigment epithelium-specific expression in vivo and in vitro	Vector Sequence
AP10022	Insulin1	1.0kb	Specific in beta- cells of the pancreas	Vector Sequence
AP10023	3Xenhancer McK	728bp	Much stronger than CMV in muscle, inactive in nonmuscle cell lines and mouse liver	Vector Sequence
AP10024	NSE	1.3kb	Neuron-specific enolase promoter	Vector Sequence

                                                                  表2. 維真提供的啟動子類型

 

                                       表3.維真提供的光敏通道蛋白類型

 

 

                                                  表4：維真部分光遺傳現(xiàn)貨

 

 

附：光遺傳技術相關文獻

 

1. 激活型光敏通道蛋白的應用

   

      2015年，Dheeraj Pelluru等發(fā)表在European Journal of Neuroscience上題為Optogenetic stimulation of astrocytes in the posterior hypothalamus increases sleep at night in C57BL/6J mice的文章中發(fā)現(xiàn)，在睡眠-覺醒周期的活動期刺激下丘腦后的星形膠質細胞會引起睡眠，從而揭示了星形膠質細胞在睡眠-覺醒調控中的重要作用。

附圖1. 通過AAV5將ChR2-EYFP特異表達在星形膠質細胞中。（Dheeraj Pelluru，2015）

 

附圖2.向星形膠質細胞使用不同的光刺激頻率對睡眠的影響。在關燈后的前6個小時，

利用光遺傳學技術使用不同頻率的藍色光（473nm，10ms）激活星形膠質細胞，分別

記錄覺醒、非快速眼動睡眠和快速眼動睡眠的時間。發(fā)現(xiàn)使用10Hz刺激表達ChR2的星形

膠質細胞時，能夠顯著提高非快速眼動睡眠和快速眼動睡眠的時間，并相應減少覺醒時

間。（Dheeraj Pelluru，2015）

 

附圖3.向星形膠質細胞使用不同的光刺激時間對睡眠的影響。在關燈后的第12個小時開始，

利用光遺傳學技術使用不同頻率的藍色光（473nm，10ms）激活星形膠質細胞，激活1min，

暫停4min，持續(xù)6小時，分別記錄覺醒、非快速眼動睡眠和快速眼動睡眠的時間。發(fā)現(xiàn)不同時

間的刺激對覺醒時間和非快速眼動睡眠時間產(chǎn)生顯著影響，并在關燈后第15個小時達到頂峰。

（Dheeraj Pelluru，2015）

 

2. 抑制型光敏通道蛋白的應用

 

      2013年，Michael T. Stefanik等發(fā)表在Front Behav Neurosci上題為Optogenetic dissection of basolateral amygdala projections during cue-induced reinstatement of cocaine seeking的文章中發(fā)現(xiàn)，通過抑制杏仁核神經(jīng)元從而投射到伏隔核中央核和前額葉，能夠降低大鼠恢復可卡因尋求的可能。

 

附圖4. 通過AAV2將ArchT特異表達于杏仁核基地外側核中，發(fā)現(xiàn)通過光照抑制神經(jīng)元活動，可降低尋求可卡因

行為恢復的可能。（A）通過561nm光照抑制杏仁核神經(jīng)元，能顯著降低大鼠主動壓桿次數(shù)；（B）DAB染色顯示

在杏仁核神經(jīng)元中過表達的ArchT-GFP；（C）通過光照抑制杏仁核神經(jīng)元獲得的降低尋求可卡因的效果，明顯優(yōu)

于沒有接受光照的效果，且接近消減給藥獲得的效果；（D）光照只帶有GFP的AAV2感染的杏仁核神經(jīng)元對實驗

無影響。（Michael T. Stefanik，2013）

 

附圖5. 通過抑制杏仁核神經(jīng)元對伏隔核中央核的神經(jīng)元的投射，可降低尋求可卡因行為恢復的可能。

（A）通過561nm光照抑制伏隔核中央核神經(jīng)元，能顯著降低大鼠主動壓桿次數(shù)；（B）DAB染色顯示在

伏隔核中央核區(qū)域中ArchT-GFP呈現(xiàn)高表達；（C）通過光照抑制伏隔核中央核獲得的降低尋求可卡因的

效果，明顯優(yōu)于沒有接受光照的效果，且接近消減給藥獲得的效果。（Michael T. Stefanik，2013）

 

附圖6. 通過抑制杏仁核神經(jīng)元對前額葉神經(jīng)元的投射，可降低尋求可卡因行為恢復的可能。

（A）通過561nm光照抑制前額葉神經(jīng)元，能顯著降低大鼠主動壓桿次數(shù)；（B）DAB染色顯示

在前額葉區(qū)域中ArchT-GFP呈現(xiàn)高表達；（C）通過光照抑制前額葉區(qū)域獲得的降低尋求可卡因

的效果，明顯優(yōu)于沒有接受光照的效果，且接近消減給藥獲得的效果。

（Michael T. Stefanik，2013）

 

附圖7. 實驗中光纖終端的位置示意圖。數(shù)字指示距離前囪點冠狀斷面處的毫米數(shù)（mm）。

（A）AAV注射杏仁核后，位于杏仁核的光纖終端位置；（B）AAV注射杏仁核后，位于伏隔

核中央核的光纖終端位置；（C）AAV注射杏仁核后，位于前額葉的光纖終端位置。

（Michael T. Stefanik，2013）

相關鏈接：

      腺相關病毒（AAV）服務