知識分享：變性梯度凝膠電泳

實驗原理

DNA 雙鏈分子在全長不斷增加溫度或用化學變性劑條件處理下，兩條鏈就會開始分開（即解鏈）。首先解鏈的區域由解鏈溫度較低的堿基組成。GC堿基對比AT堿基對結合得要牢固，因此GC含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力。解鏈溫度低的區域，通常位于端部稱作低溫解鏈區。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區域便稱作高溫解鏈 (圖1) 。

圖1

如果溫度或變性劑濃度繼續升高，兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據首要的一點是：DNA雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據是，如果某一區域首先解鏈，而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度，其電泳速度也會有明顯差別。因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開（圖 2, 1 和 2 道）。

圖2

最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區堿基錯配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈，后者是在PCR擴增加時產行的。而含有錯配的雙鏈（圖2中的3和4道）通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈（圖2中1和2道）分開，這種分離效果使該方法靈敏度很高。為使僅有一個堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的DNA范圍以及電泳樣品時變性劑濃度梯度。這可以按圖 2 所示的正交變性梯度實驗進行經驗性地解決。變性劑梯度應選在曲線斜率大的部分，因為這時多數分子處于部分變性狀態這使得落入低溫解鏈區的不同分子達到最佳分離。

現在多數分析實驗是加入了“GC夾板”（clamp）。它是將一段長度為30-50堿基，富含GC的DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人為高溫解鏈區。這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區從而可以對其進分析。

實驗材料

1、實驗儀器：電泳控溫槽一臺、電泳支架、程控電泳儀、梯度混合儀一套、緩沖液虹吸泵、凝膠成像儀；

2、實驗試劑：

（1）40%的凝膠單體（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺：37.5/1）：稱取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉雙丙烯酰胺，加入去離子水定容至100ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（2）100%變性劑：取42ml去離子甲酰胺、42g尿素，用去離子水定容至100 ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（3）50×TAE緩沖液（Tris 2mol/L， 冰醋酸 1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0） ；

（4）10%過硫酸銨溶液（W/V，為保證良好的引發效果，建議現配現用） ；

（5）TEMED（分析純）。

（6）梯度變性膠的配方（濃度為8%的變性膠）

（7）梯度變性膠的配方（濃度為6%的變性膠）

實驗過程

1、將兩塊玻璃對齊放入電泳支架上（帶缺口的玻璃缺口朝上并位于內側），旋緊固定螺絲并夾好夾子。注入去離子水，檢測是否漏水后倒出去離子水。

2、配制高變性劑濃度凝膠溶液和低變性劑濃度凝膠溶液，在灌膠前加入適量的10%過硫酸銨溶液和TEMED作為聚合引發劑和催化劑并充分混勻。關閉梯度混合儀的兩個閥門，將高濃度變性劑凝膠溶液加入梯度混合儀靠近出口的一端，將低濃度變性劑凝膠溶液加入另一端，并打開磁力攪拌器。

3、先打開梯度混合儀出口端閥門，待液流穩定無氣泡時將針頭插入兩塊玻璃縫隙中部，接著打開梯度混合儀中間閥門開始灌膠。

4、待凝膠灌至距上端1.5cm處時停止灌膠，加入1mL去離子水液封膠面，待凝膠聚合后，配制不含變性劑的0%凝膠，用移液器灌膠，插好梳子，待凝膠完全聚合。

5、拔出梳子，將電泳支架放入恒溫電泳槽，將各個PCR產物與Loading buffer混勻，然后用微量上樣器吸取樣品并加到各個上樣孔中（每個孔的DNA含量為500-800ng，PCR產物在瓊脂糖電泳時與Marker比較計算其大概含量，使得梯度變性膠每個孔樣品中的DNA含量盡量一致）。 一切就緒后，準備開始電泳，電壓設定為第一階段60V，時間1h 第二階段100V，時間16h，電泳儀全自動定時分段編程。

6、電泳結束后，拿出電泳架取出玻璃，將一側玻璃揭去，用EB或SYBR Green染色30min后取出凝膠，置于凝膠成像儀中拍照。

注意事項

1、實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得較多易揮發有機試劑和有毒試劑，操作過程中須注意做好防護。

2、膠濃度根據PCR產物片段長度選定，一般150-400bp的選用8％的膠，400bp以上的選用6％的膠。

3、變性劑濃度范圍根據文獻報道并針對具體樣品做適當調整，使最終條帶位于變性膠中部。

4、引發劑和催化劑的具體用量可以根據氣溫以及實驗人對聚合速度的要求等具體實驗情況進行調整，文檔表格中列出的是參考用量。

5、配膠用的玻璃板須洗刷干凈，避免雜質引起氣泡等影響凝膠的一體性，加入凝膠液之前須注意檢查玻璃板是否漏水。

6、拔取梳子的時候要注意切勿破壞上樣孔，可先將凝膠放入電泳緩沖液中浸泡，然后拔取。

7、電泳槽中提前裝入1×TAE緩沖液21L，溫度設置為60°C，插上電極和緩沖液循環管，預熱電泳緩沖液。

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