IPTG誘導蛋白表達的實驗方法

實驗原理：

E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節 基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結合，使操縱子（元）受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激 活蛋白（CAP）結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區，三個酶的編碼基因即由同一調控區調節，實現基因產物的協調表 達 。

在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結 合，抑制轉錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經β-半乳糖苷酶催化，轉變為異乳糖。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白，使蛋白構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用與異乳糖相同，是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定，因此被實驗室廣泛應用。

實驗試劑：

1、LB（Luria-Bertani）培養基：酵母膏(Yeast extract)5g 、蛋白胨(Peptone) 10g 、NaCl 10g 、瓊脂(Agar) 1-2% 、蒸餾水(Distilled water) 1000ml 、pH 7.0。

2、IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，-20 ℃ 保存。

3、凝膠電泳加樣緩沖液 ：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 、50 mmol / L DTT、 2 % SDS （電泳級）、 0.1 ％ 溴酚藍 、10 ％ 甘油。

實驗步驟：

1、用適當的限制性內切核酸酶消化載體DNA和目的基因；

2、按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到轉化DH5α感受態細胞中；

3、分別挑取單菌落接種于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨芐青霉素)中，37℃培養過夜；

4、以2 %體積比轉接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨芐青霉素)中，37℃繼續培養2.5 hr，至細菌對數生長期，加0.1 mmol/L IPTG 2 µl誘導3-4 hr，同時設立不加IPTG誘導作為對照； 

5、取上述菌液1 mL，12000 rpm離心10min，收菌沉淀；

6、重懸于冰的100 µl PBS中，加入PMSF至終濃度為10 mmol/L。震蕩器震蕩混勻，加入2×加樣緩沖液，煮沸10 min變性，12,000 rpm離心10 min；

7、分別取誘導前和誘導后的樣品10 µl進行SDS-PAGE電泳分析。

（PS：如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃培養數小時，使培養液的OD600達0.4-0.6，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續培養3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養細菌數小時達到對數生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L，繼續培養3 -5h）

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