如何摸索慢病毒最佳MOI值

MOI （multiplicity of infection），即感染復數，指的是感染時病毒與細胞數量的比值。一般認為MOI是一個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfu number/cell。但對于某些病毒如AAV病毒，無法用pfu表示病毒的數量，而是采用TU、IU、病毒顆粒（viral particles, v.p）或基因組數量（vector genome,v.g.）來表示病毒數量。

慢病毒（Lentivirus）載體是基于HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）的單鏈RNA病毒載體，可感染分裂或非分裂細胞，并將外源基因有效地整合到宿主染色體上，且具有較低的免疫原性，被廣泛應用于各種體外細胞實驗中。

• 常見細胞MOI參考值（慢病毒）

• 慢病毒MOI值摸索步驟

• 實驗前信息準備

• MOI梯度設置

在查閱到的參考MOI值前后各設置2個梯度，每個梯度至少相差2倍，舉例：查閱到某細胞系在文獻中慢病毒MOI應用為10，則設置MOI梯度為2.5-5-10-20-40。

根據公式計算所需添加的病毒量：

MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細胞個數

• 鋪細胞

在96孔板中鋪1×10⁴個細胞/孔，培養基定容至100μL/孔；

• 慢病毒感染

       依據所計算出的病毒體積，逐個孔添加慢病毒，并于感染次日更換新鮮培養基。

（5）確定MOI范圍

a．帶熒光標簽的慢病毒：觀察熒光

感染后72小時后，于熒光顯微鏡下觀察細胞狀態和熒光情況，確定細胞狀態較好且熒光數較多的孔，對應為較適宜的MOI值。

• 不帶熒光標簽的慢病毒：抗性篩選（puromycin/blasticidin等）

查閱相應抗性素在相應細胞株中的篩選濃度，于感染后72小時加入藥物，培養3-5天，鏡下觀察，選取細胞存活率較高且細胞狀態較好的孔，對應為較適宜的MOI值。

（6）縮小MOI范圍進行二次摸索（附加步驟）

如需較為精確的MOI值，可在步驟（5）中確定的MOI范圍內再設置MOI梯度，實驗方法同步驟（3）—（5）。舉例：

• 慢病毒感染中的常見問題

（1）怎樣提高慢病毒的感染效率？

細胞良好的生長狀態是達到高感染效率的保證。必要時可在感染時加入助感染試劑ADV-HR來提高慢病毒的感染效率。

（2）助感染試劑ADV-HR的使用濃度和使用方法是什么？

助感染試劑ADV-HR能夠顯著提高慢病毒的感染效率，并呈現劑量和時間依賴效應。但較高濃度的ADV-HR具有細胞毒性，影響細胞狀態和感染效率。我們建議您務必于目的細胞中進行ADV-HR濃度梯度預實驗。我們在HEK293中的實驗表明，當ADV-HR使用濃度小于等于1.0×10^-2mg/mL時，細胞狀態良好。

（3）慢病毒感染后為什么細胞中出現大量黑點，并影響細胞生長？

    在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片，導致細胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：a. 慢病毒使用量過多，或細胞數量過少；b. 支原體污染。

    由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發，故會出現大量細胞碎片。我們建議在使用病毒制品時，應首先排除細胞、培養物及培養環境中的支原體污染，以節約您的寶貴時間。

（4）慢病毒應如何保存？

    建議您于收貨后第一時間分裝，并將病毒儲存于液氮或-80℃。切勿反復凍融！在未經凍融情況下，持續-80℃儲存環境可質保6個月，超出該儲存條件則需重新進行質控鑒定。