知識分享：AAV在肺部的應用

腺相關病毒（AAV）屬于依賴病毒屬，細小病毒亞科，是一類自然缺陷的單鏈DNA病毒。野生型AAV基因組約4.7kb，含有rep和cap基因以及兩端的ITR序列。盡管人類對AAV易感，但臨床還并未發(fā)現(xiàn)與AAV相關的疾病。根據(jù)AAV衣殼蛋白基因的變異，可將AAV分為不同的血清型。不同血清型的AAV具有不同的組織特異性。將興趣基因取代rep和cap基因構建一個兩段帶有ITR的載體，并將rep和cap置于一個獨立的載體上，加上帶有腺病毒輔助基因載體，便可包裝出帶有興趣基因的重組腺相關病毒（rAAV）。

目前rAAV已被廣泛作為基因轉導載體使用，rAAV在人體實驗中的安全性也已被證實。早在1996年，科學家們就選擇肺作為rAAV的第一個靶向?qū)嶒炂鞴佟Ｏ旅嫖覀冎荚诮榻BrAAV在肺部實驗中的啟動子、血清型的選擇，及其小鼠肺部的AAV注射方法。

• 啟動子的選擇

根據(jù)不同的注射方式和實驗目的，可選擇不同的啟動子以提高肺部表達效率。CMV在啟動真核基因表達方面具有極高的效率，可高效感染小鼠肺部；CAG同樣具有出色的感染氣道的能力。

• 血清型的選擇研究表明，針對肺部感染rAAV在血清

研究表明，針對肺部感染rAAV在血清型上的選擇根據(jù)動物模型的不同而存在差異，主要體現(xiàn)在小鼠及較低等靈長類動物與高等靈長類動物中之間。

 在小鼠及一些較低等的靈長類動物中，AAV5及AAV6是感染肺部的最佳選擇。

針對高等靈長類動物，AAV1對肺部的感染效率更高；而在肺癌的研究中，我們推薦AAV血清型選擇如下：

• 小鼠肺部AAV注射方法

AAV感染肺部有多種方法，較為常用的方法為鼻內(nèi)滴注、氣管插管、氣管內(nèi)注射等。當對肺部感染AAV的特異性要求較低時，也可采用靜脈注射的方法；當進行肺癌成瘤實驗時，也可采用瘤內(nèi)注射的方式。

在此，我們針對鼻內(nèi)滴注、內(nèi)鏡輔助口腔氣管插管術及氣管內(nèi)注射進行介紹。

• 鼻內(nèi)滴注法

鼻內(nèi)滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡單且對設備要求低，對新手實驗員也同樣適用。缺點是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實現(xiàn)。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運動或?qū)�載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

（2）將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上；

（3）將門牙環(huán)置于小鼠上門牙上，并將尼龍搭扣連接到嚙齒動物工作臺下表面的相應尼龍搭扣上；

（4）慢慢地將AAV懸液通過小鼠鼻孔內(nèi)壁逐滴滴入，為保證最大地肺部感染效率，最小體積為50μL（每個鼻孔25μL），最大體積為75μL（每個鼻孔37.5μL）。待小鼠呼吸恢復正常后，再滴入一次75μL的AAV懸液；

（5）將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；           

（6）小鼠蘇醒后，放回鼠籠。

• 內(nèi)鏡輔助口腔氣管插管術

口腔氣管插管術能夠?qū)⒉《据d體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術的風險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達肺內(nèi)，所以要嚴格控制AAV的使用量。同時，與鼻內(nèi)滴注法相比，口腔氣管插管術需要一些特殊設備，操作起來也稍有難度。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運動或?qū)�載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上；

• 將門牙環(huán)置于小鼠上門牙上，并將尼龍搭扣連接到             嚙齒動物工作臺下表面的相應尼龍搭扣上；
• 小鼠的背部應完全平放在工作臺上，胸部不應偏向兩側，并用尼龍扣完全固定；

• 用尖頭棉棒把小鼠的舌頭卷起；
• 輕輕地把附有耳鏡的插管鏡插入喉嚨深部的氣管開口處（大約在耳朵前部），插管鏡的凹面應遠離舌頭；
• 輕輕移動耳鏡直到可以看到喉部（有時需稍微旋轉鏡子，以獲得最佳視野）；操作時需注意動作幅度要小，如果只能看到舌頭背面，則需重新移出從頭開始操作；
• 當可以看清喉部時，便可加入一滴2%的利多卡因，在插管前，插管鏡可移出（小于30s），在此期間要定位導管針；
• 30秒以后，重復步驟（3）—（5），重新插入插管鏡，重新找到可以看清喉部的位置；
• 重新可以看清喉部后，導管針首先進入氣管開口，針到位后，插管鏡可以移出，然后引導導管緩緩向下，直到導管的中心（粉色部分）接觸到小鼠門牙，每只小鼠不要嘗試2次以上插入導管；
• 一旦導管到位，要把針移出以便小鼠正常呼吸；
• 確定導管在氣管內(nèi)的正確位置；
• 用0.35mL的注射器通過導管按照3μL/g體重輸入AAV；
• 立刻使用1mL無針頭注射器輸入0.2mL空氣，并重復2-3次以減少AAV在導管內(nèi)的殘留；
• 把導管移出；
• 將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對小鼠狀態(tài)進行監(jiān)測直到其蘇醒，預計在24到36小時之內(nèi)會恢復輕到中度的呼吸。

• 氣管內(nèi)注射

與鼻內(nèi)滴注相比，氣管內(nèi)注射能夠提高AAV進入肺部的效率；而與口腔氣管插管法相比，設備更簡單，操作更容易。與此同時，氣管內(nèi)注射具有極高的外科手術風險，包括出血、切口開裂、感染以及較長的恢復期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，也很容易出現(xiàn)失誤，將AAV注射到氣管周圍組織或食管中去。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運動或?qū)�載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上，固定好下巴和四支前端，并保證小鼠在45°斜面上，頭略微抬高；
• 去除小鼠頸腹側的毛發(fā)（從喉嚨至胸）；
• 使用濕潤的紗布海綿清洗脫毛區(qū)域，再用含氯溶液擦拭皮膚，最后用70%酒精擦拭；
• 在小鼠頸上部切一4mm左右切口；
• 使用組織鑷輕輕穿過皮下組織，找到頸部帶狀肌覆蓋的氣管；
• 在帶狀肌上輕輕切口暴露氣管；
• 一旦可以看到氣管，將針頭斜面向上平行插入氣管，針尖指向肺部，按照3μL/g體重輸入AAV，然后將針拔出；
• 將切口縫合或使用皮膚膠水粘合；
• 將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對小鼠狀態(tài)進行監(jiān)測直到其蘇醒。