real-time/qPCR 常遇到的那些事！！！（原因解讀）

通常來(lái)講，real-time PCR（ qPCR）的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在 80～150 bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。 
 
SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來(lái)形成溶解曲線，判斷 PCR 產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。 
 
1、無(wú) Ct 值出現(xiàn) 
 
檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時(shí)采集，Taqman 法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。 
引物或探針降解：可通過(guò) PAGE 電泳檢測(cè)其完整性。 
模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 
模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。 
 
2、Ct 值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38） 
 
擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 
PCR 各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。 
PCR 產(chǎn)物太長(zhǎng)： 一般采用 80～150 bp 的產(chǎn)物長(zhǎng)度。 
 
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳 
 
加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。 
標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 
引物或探針不佳：重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。 
模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高。 
 
4、負(fù)對(duì)照有信號(hào) 
 
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。 
引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 
鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 
模板有基因組的污染：RNA 提取過(guò)程中避免基因組 DNA 的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。 
 
5、擴(kuò)增效率低 
 
反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 
反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。 
反應(yīng)體系中有 PCR 反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。 
 
6、擴(kuò)增曲線異常，比如 S 型曲線 
 
參比染料設(shè)定不正確：MasterMix 不加參比染料時(shí)，選 NONE。 
模板的濃度太高或者降解。 
熒光染料的降解。 
 
7、定量 PCR 儀的開(kāi)關(guān)機(jī)順序是怎樣的？ 
 
按照正確的開(kāi)關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。 
開(kāi)機(jī)順序：先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量 PCR 儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量 PCR 的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 
　　 
關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR 儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。 
 
9、什么是 CT 值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？ 
 
CT 值與起始 DNA 濃度的對(duì)數(shù)成反比： 
如果：不同管之間的 PCR 反應(yīng)效率相同。這些 PCR 的反應(yīng)效率接近 100%。可以從上面的公式推出相對(duì)含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后 0、24、48 小時(shí) IL-2 基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對(duì)照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的測(cè)定結(jié)果都是 CT 值，而沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總 RNA 的 pg 數(shù)。　 
　 
10、定量 PCR 基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？ 
 
總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。 
參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映 PCR 進(jìn)程。ROX 校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。 
內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。 
計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品（Calibrator）的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0 小時(shí)和 6 小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6 小時(shí)/0 小時(shí)、患病/正常。 
 
11、怎樣判斷定量 pcr 儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？ 
 
一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。 
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行 ROI 的校正，當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。 
清除樣本加熱塊污染的步驟如下： 
用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。 
吹打數(shù)次。 
將廢液吸入廢液杯中。 
重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。 
確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。 
 
12、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？ 
 
是同樣可靠的。 
內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件最接近一致，缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它們的 PCR 效率有差異。 
外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒(méi)有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì)導(dǎo)致它們的 PCR 效率有差異。 
兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。 

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