免疫組化常見問題及對策

免疫組織化學(xué)是應(yīng)用抗原和抗體結(jié)合的原理，檢測細胞內(nèi)多肽、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分布。這種方法的特異性強、敏感度高、發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)眾多學(xué)科的重要研究手段。做免疫組化可能遇到許多問題，大體歸納起來，主要有非特異性著色﹑著色部位不對﹑假陽性﹑無陽性﹑陽性弱五大類以及其他一些小問題。現(xiàn)在就以上幾點分別說明。

1、非特異性著色

非特異性著色就是在理論著色區(qū)域外的著色，這種著色與背景是有區(qū)別性的。造成非特異性著色的原因主要有：

1) 標(biāo)本原因，肝腎內(nèi)源性生物素含量高，與 SABC 結(jié)合導(dǎo)致非特異性著色，皮膚，肺組織膠原含量高，由于膠原帶負電荷，易吸附試劑導(dǎo)致非特異性著色。

2) 切片干涸導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)。

3) 抗體濃度過高。

4) 組織在處理中存在出血區(qū)或壞死區(qū)。

5) 洗滌不充分。

6) 顯色劑氧化，顯色時間長。

解決方法 ：

1) 一抗應(yīng)做濃度梯度，選擇陽性強背景好，信躁比高的濃度，做為抗體實驗濃度。二抗?jié)舛群蜁r間一般不變。

2) 穩(wěn)定實驗條件，嚴(yán)格按操作說明進行。

3) 在實驗中應(yīng)保持切片始終處于水平狀態(tài)避免抗體流失，從而使切片使切片干涸。

4) 在實驗中應(yīng)將試劑覆蓋面積大于切片面積

5) 洗滌要充分，在背景十分深時，可用 37 ℃ 預(yù)溫的 PBS 浸泡

6) 顯色劑的配制要防止氧化，尤其是顯色劑的配制是使用的用的容器，最好是滅菌過的。顯色時間應(yīng)在顯微鏡下嚴(yán)格控制。

2、著色部位不對

著色部位不對有三種情況。

情況一 : 本是胞漿抗原，但實驗顯示結(jié)果卻在胞核有著色。

原因及解決辦法：

1) 修復(fù)時間過長，修復(fù)條件十分嚴(yán)苛，這時應(yīng)降低反應(yīng)強度

2) 組織在二甲苯中靜置時間過長，這時應(yīng)更換標(biāo)本。

3) 抗體中含有抗核蛋白抗體，這種情況已不多見。

4) 標(biāo)本原因，標(biāo)本處理不慎會導(dǎo)致總在同一個地方出現(xiàn)著色。

情況二 : 本是胞核抗原但顯示結(jié)果卻在胞漿。

原因及解決辦法：

1) 核抗原不易暴露，需用熱修復(fù)或延長修復(fù)時間來充分暴露。

2) 蛋白質(zhì)是在胞漿翻譯的，再轉(zhuǎn)運至其他部位，所以出現(xiàn)漿著色也屬正常。

情況三 : 本是胞膜抗原但顯示結(jié)果卻是在胞漿和胞膜都有著色。

原因：蛋白質(zhì)是在胞漿翻譯的，再轉(zhuǎn)運至其他部位，處于轉(zhuǎn)運過程中的膜蛋白有可能顯示在胞漿。

3、假陽性

如不加一抗也有陽性信號主要原因是二抗引起的交叉，球蛋白是一個超家族，哺乳動物種屬來緣近的容易發(fā)生交叉反應(yīng)。如：羊抗兔抗體可與兔標(biāo)本中球蛋白反應(yīng)，二抗羊抗小鼠也可與大鼠，小鼠中的球蛋白起反應(yīng)，尤其在修復(fù)的情況下。

4、無陽性

原因：

1) 抗原穩(wěn)定性問題，由于許多蛋白質(zhì)半衰期短易被破壞。

2) 標(biāo)本制作過程中烤片時間過高時間過長，標(biāo)本制作不規(guī)范。

3) 實驗中漏加試劑，實驗操作不規(guī)范。

解決方法：

1) 在標(biāo)本固定中應(yīng)該嚴(yán)格操作，做到及時固定。

2) 在浸蠟時溫度不要太高，時間不要過長。一般 2小時×2次。烤片溫度一般在60℃左右2小時。

3) 實驗中要嚴(yán)格按照實驗步驟操作。在所做指標(biāo)既有單抗又有多抗時，要將一抗和二抗嚴(yán)格對應(yīng)。

5、陽性弱

原因及解決方法：

1) 一抗?jié)舛冗^低，解決方法：提高一抗?jié)舛?/p>

2) 孵育時間過短，解決方法：按說明書嚴(yán)格操作

3) 抗體流失，解決方法：補加抗體

4) 顯色時間過短，解決方法：在顯微鏡下控制反應(yīng)時間

5) 抗原修復(fù)方法不當(dāng)，抗原修復(fù)有許多種方法，如：修復(fù)、消化，不消不修，尋找適合的方法是解決陽性弱的有效方法之一。

6、其他問題及注意事項

在實驗中尤其在修復(fù)后切片容易脫片。切片脫片的原因是什么？

答：切片原因有以下幾點。 1). 切片沒有經(jīng)過防脫片處理。

 2). 在切片后沒有及時烤片。

 3). 修復(fù)時間過長。

來源：BOSTER

 

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