熒光定量PCR具體使用操作步驟簡介
操作步驟
熒光定量PCR 實驗步驟:
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
1)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下:
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為:
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②準(zhǔn)備RNA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。
①反應(yīng)體系
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序號 |
反應(yīng)物 |
劑量 |
|
1 |
逆轉(zhuǎn)錄buffer |
2μl |
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2 |
上游引物 |
0.2μl |
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3 |
下游引物 |
0.2μl |
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4 |
dNTP |
0.1μl |
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5 |
逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV |
0.5μl |
|
6 |
DEPC水 |
5μl |
|
7 |
RNA模版 |
2μl |
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8 |
總體積 |
10μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。
管家基因(β-actin)實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為10，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為10，依次稀釋至10、10、10、10、10、10，以備用。
②反應(yīng)體系如下:
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
|
序號 |
反應(yīng)物 |
劑量 |
|
1 |
SYBR Green 1 染料 |
10μl |
|
2 |
陽性模板上游引物F |
0.5μl |
|
3 |
陽性模板下游引物R |
0.5μl |
|
4 |
dNTP |
0.5μl |
|
5 |
Taq酶 |
1μl |
|
6 |
陽性模板DNA |
5μl |
|
7 |
ddH2O |
32.5μl |
|
8 |
總體積 |
50μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應(yīng)體系:
|
序號 |
反應(yīng)物 |
劑量 |
|
1 |
SYBR Green 1 染料 |
10μl |
|
2 |
內(nèi)參照上游引物F |
0.5μl |
|
3 |
內(nèi)參照下游引物R |
0.5μl |
|
4 |
dNTP |
0.5μl |
|
5 |
Taq酶 |
1μl |
|
6 |
待測樣品cDNA |
5μl |
|
7 |
ddH2O |
32.5μl |
|
8 |
總體積 |
50μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為:93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。
①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。
反應(yīng)體系:
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序號 |
反應(yīng)物 |
劑量 |
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1 |
10×PCR緩沖液 |
2.5 ul |
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2 |
MgCl2溶液 |
1.5 ul |
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3 |
上游引物F |
0.5 ul |
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4 |
下游引物R |
0.5 ul |
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5 |
dNTP混合液 |
3 ul |
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6 |
Taq聚合酶 |
1 ul |
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7 |
cDNA |
1 ul |
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8 |
加水至總體積為 |
25ul |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。
②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×10，依次稀釋至10、10、10、10、10、10幾個濃度梯度。
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。
體系配置如下:
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序號 |
反應(yīng)物 |
劑量 |
|
1 |
SYBR Green 1 染料 |
10 ul |
|
2 |
上游引物 |
1ul |
|
3 |
下游引物 |
1ul |
|
4 |
dNTP |
1ul |
|
5 |
Taq聚合酶 |
2ul |
|
6 |
待測樣品cDNA |
5ul |
|
7 |
ddH2O |
30ul |
|
8 |
總體積 |
50 ul |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。
引物設(shè)計軟件:Primer Premier 5.0，并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
