RNA實驗和方案新手必讀（二）

瀏覽次數：6523　發布日期：2015-3-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

RNA操作常見注意事項

核糖核酸酶（RNase）是非常穩定、活躍的酶，它們通常不需要輔因子就能發揮功能。由于核糖核酸酶難以失活，并且很小的量就足以破壞RNA分子，因此在沒有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情況下，不要使用任何塑料或者玻璃器皿。處理RNA時應非常小心，以避免在純化的過程中或者純化之后，將核糖核酸酶無意的引入到RNA樣品中。為了創造并維持沒有核糖核酸酶的環境，在預處理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液處理RNA時，一定要采取以下預防措施。

常規操作

處理RNA時，一定要使用合適的微生物學的無菌技術。手和灰塵顆粒可能會攜帶細菌和霉菌，是最常見的核糖核酸酶污染源。為了阻止來源于皮膚表面或者實驗室器械灰塵上的核糖核酸酶污染，在操縱試劑以及RNA樣品的時候，一直要佩戴乳膠手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情況下，要經常更換手套，并將試管處于關閉狀態。當用移液管吸取溶液用于下游應用時，要將純化過的RNA放在冰上。

為了去除工作臺表面、非一次性塑料器皿和實驗室器械（比如，移液管和電泳槽）上的核糖核酸酶污染，推薦使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常見的實驗室試劑去除核糖核酸酶的污染。為了去除塑料器皿上的污染，使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗滌，然后使用去RNase的水洗滌；如果塑料器皿具有耐氯仿性，則可用氯仿洗滌。為了去除電泳槽的污染，可使用去污劑清潔（比如，0.5%的SDS），使用去RNase的水洗滌，然后用乙醇洗滌（如果電泳槽具有耐乙醇性），之后晾干。

重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套，以及具有護目鏡。請參考產品廠商提供的相應安全數據說明書（SDS），了解更多信息。

一次性塑料耗材

在處理RNA的時候，推薦使用無菌的，一次性的聚丙烯管。這些試管通常沒有核糖核酸酶，因此不需要預處理使核糖核酸酶失活。

非一次性的塑料耗材

非一次性的塑料耗材在使用之前應該進行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材應該嚴格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗滌，然后用去RNase的水洗滌。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗滌，以使核糖核酸酶失活。

玻璃器皿

玻璃器皿在使用之前，應該進行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。用于處理RNA的玻璃器皿在使用之前，應該使用去污劑清潔，嚴格的洗滌，并在240°C的烘箱中烘烤至少4小時（如果更方便的話，可以過夜）。也可以使用DEPC（焦碳酸二乙酯）處理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC（0.1%的水溶液）充滿玻璃器皿，在37°C的條件下過夜（12小時），然后使用高壓釜處理或者加熱到100°C 15分鐘，以去除剩余的DEPC。

重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產品廠商提供的安全數據說明書（SDS），了解更多信息。

電泳槽

電泳槽應使用去污劑（比如，0.5%的SDS）清潔，嚴格的用去RNase的水洗滌，然后使用乙醇洗滌，之后晾干。

重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產品廠商處提供的相應安全數據說明書（SDS），了解更多信息。

重要：一些電泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性，需要仔細查閱廠商說明書。

溶液

溶液（水或者其它溶液）應該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強大但非絕對的RNase抑制劑，它通過共價修飾RNase發揮作用。

重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產品廠商提供的相應安全數據說明書（SDS），了解更多信息。

不含RNase的溶液的制備

溶液（水或者其它溶液）應該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強大但非絕對的RNase抑制劑。濃度為0.1%的DEPC經常用于處理玻璃或者塑料耗材，以使其表面的RNase失活，或者制備不含RNase的的溶液和水。DEPC通過共價修飾使RNase失活。在100 ml要處理的溶液中加入0.1 ml DEPC，大力的搖晃，以使DEPC充分進入溶液。將溶液在37°C的條件下孵育12個小時。在高壓滅菌器內處理15 min以去除任何DEPC的痕跡。DEPC與伯胺發生反應，因此不能直接用于處理Tris緩沖液。在Tris緩沖液存在的條件下，DEPC非常不穩定，迅速分解為乙醇和CO2。在制備Tris緩沖液時，應先使用DEPC處理水，然后將Tris溶解以制備合適的緩沖液。痕量的DEPC會通過乙酰基化作用，與RNA分子中的嘌呤殘基反應，將其修飾。在細胞外的環境中，乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻譯。但是，除非有大量的嘌呤殘基被修飾了，否則不會嚴重的影響這些RNA分子雜交形成DNA：RNA或者RNA：RNA雜交物的能力。溶液或者器皿上殘留的DEPC，一定要在高壓滅菌器中處理或者加熱到100°C處理15 min，以便除去。

生物樣本中RNA的穩定處理

為了確保基因表達分析的精確性，所分析的RNA應能夠準確地反映出其在生物樣本中的體內表達情況。但實際在樣本的操作和RNA的分離過程中，RNA很容易發生改變而使情況變得復雜。

生物樣本一經提取，其中的RNA即變得極不穩定。期間所發生的人為影響主要分成兩種。基因的下調和RNA的酶促降解會導致mRNA特異性或非特異地發生人為降低。同時在操作和加工樣本的過程中，某些基因會被誘導表達。這兩種效應的綜合可能在檢出的轉錄譜與體內真實情況之間造成偏差。

對RNA表達譜進行即刻的穩定化處理是精確基因表達分析中的首要事項。通常情況下，用于RNA分析的樣本被迅速置于液氮中冷凍，在進一步處理之前一直儲存于–80°C下。產品供應商也提供了一些穩定處理試劑，作為替代方法對生物樣本中的RNA進行穩定化處理。這些供應商提供了集成化的樣本處理溶液（套裝），其中包括容器，穩定處理試劑及制備試劑盒

RNA的大小和分子量

不同RNA的大小和分子量 RNA	核苷酸	分子量（道爾頓）
E. coli tRNA 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA	75 120 1541 2904	2.6 x 104 4.1 x 104 5.2 x 105 9.9 x 105
果蠅 18S rRNA 28S rRNA	1976 3898	6.7 x 105 1.3 x 106
小鼠 18S rRNA 28S rRNA	1869 4712	6.4 x 105 1.6 x 106
兔子 18S rRNA 28S rRNA	2366 6333	8.0 x 105 2.2 x 106
人 18S rRNA 28S rRNA	1868 5025	6.4 x 105 1.7 x 106