RNA實驗方案和應用（一）

RNA是具有多種不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA轉錄得到的，用做蛋白質合成的模板。蛋白質的合成是由核糖體完成的，核糖體由核糖體RNA（rRNA）和蛋白質組成。用于蛋白合成的氨基酸，是通過轉運RNA（tRNA）輸送到核糖體上的。RNA分子也是參與RNA轉運過程的核糖蛋白的一部分。非編碼RNA也是非常重要的。它們是不翻譯成蛋白質的功能RNA分子。這樣的RNA分子包括tRNA、rRNA、核仁小RNA（snoRNA）、微小RNA（miRNA）、小干擾RNA和piwi-interacting RNA（piRNA）。它們通常在基因表達的調控中發揮作用。

miRNA是一類內源性的（自然產生的），約18–24個核苷酸大小的非編碼RNA，在轉錄后的基因調控中發揮作用。一個miRNA可能在每個細胞中有超過105個拷貝，但是從每個細胞中總RNA質量的角度來看，這些RNA又是微不足道的。由于它們非常短，因此通常需要特別的分離和分析方案。

一個典型的快速生長的哺乳動物細胞培養中,每個細胞大約含有10–30 pg的RNA，而一個完全分化的原代細胞中，RNA的量要少得多——大約每個細胞中RNA的含量小于1 pg。細胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大約占細胞中RNA總量的1–5%，但是具體的量取決于細胞類型和細胞的生理狀態。一個動物細胞中，大約有360,000個mRNA分子，組成了大約12,000個轉錄本，一個典型轉錄本的長度大約為2 kb。一些mRNA分子占到了總mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。這些“稀有的”或者“低豐度”的mRNA分子在每個細胞中只有5–15個拷貝。但是，這些稀有的mRNA大約有11,000種，占到了mRNA數量的45%。

一個生物體中的基因是相對固定的，因此，mRNA的組成代表了在給定的條件下，基因的表達方式。使用雜交技術，包括RNA印跡法（northern印跡）和微陣列分析，或RT-PCR技術、轉錄本測序技術（RNA-seq）對RNA進行分析，能夠充分反映一個生物體中的基因表達譜。但是，與DNA相比，RNA相對不穩定。這很大程度上是由于存在會降解RNA分子的核糖核酸酶(RNases)。

核糖核酸酶非常的穩定，不需要輔因子，在非常低濃度的時候就有很高的催化效率，并且不容易失活。核糖核酸酶的污染可以來自于人類的皮膚和攜帶有細菌和霉菌的塵埃顆粒。因此，RNA的分離和分析需要特別的技術。

* 由于物種、發育階段和生長條件的不同，含量有可能不同。

小RNA（miRNA）是一類內源性的（自然產生的），約22個核苷酸的非編碼RNA分子，它們參與轉錄后的基因調控。它們與siRNA分子具有類似的特征。

miRNA分子在很多生物學過程中發揮了重要作用，包括細胞的分化和發育，細胞信號轉導和對感染的應答等。大量的證據顯示，miRNA表達的紊亂是一些疾病發生的原因和標志，包括多種癌癥。在血清和血漿中可檢測到無細胞的miRNA分子，而疾病會導致它們表達水平變化。這些發現，使得無細胞miRNA的表達很可能作為疾病診斷和預防中的生物標志物。

miRNA和siRNA的途徑都與雙鏈RNA相關，但是這些RNA分子的來源不同。與誘導RNA干擾的雙鏈RNA不同，miRNA是由基因組編碼的。除此之外，miRNA的前體（pre-miRNA）不完全是雙鏈的，而是包含有雙鏈區域的發卡結構。與RNAi不同（參考RNAi），miRNA的作用主要是調節細胞自己的基因。人類具有超過2000種miRNA分子，據估計，它們調節超過三分之二的人類基因。

miRNA系統是調節基因表達的內源性機制。成熟的miRNA分子，主要通過翻譯抑制來調控內源性基因的表達。除此之外，miRNA能通過快速的脫腺苷化作用和去除帽子來摧毀mRNA。自然生成的miRNA分子的結合位點，通常在目標mRNA 3’端的非翻譯區。在動物的miRNA分子中，序列的部分匹配給確定真正的結合位點帶來困難，并且降低了結合位點確定的準確性。

miRNA 模擬物是化學合成的，雙鏈RNA分子（通常長度為18–24個核苷酸），通過轉染到細胞中，模擬成熟的內源性miRNA分子。miRNA抑制劑是單鏈（通常長度為21–25個核苷酸），經過修飾的RNA分子，通過轉染到細胞中，特異性的抑制miRNA的功能。模擬物和抑制劑包含一些化學修飾，以便提高活性或者增強其在體內的穩定性。

通過將miRNA模擬物轉染到細胞中，并進行下游的基因表達分析或者表型分析，可以闡明特定miRNA分子的目標和發揮的作用。這些實驗可以研究單個miRNA錯誤調節所造成的生物學影響，也能用于確定某個miRNA分子的特異性靶標基因。miRNA轉染之后，如果降低或者提高基因的表達水平，說明研究的miRNA參與調節了這個基因的表達。類似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通過檢測miRNA模擬物或者抑制劑轉染之后的特定表型來研究。

miRNA模擬物/抑制劑轉染對于下游應用的影響，通常可以通過如下方案來分析：

• 攜帶有報告基因，比如熒光素酶，和一個或者多個位于3’端非翻譯區的miRNA結合位點的質粒載體做為miRNA的靶標。miRNA的模擬物/抑制劑與載體共轉染到細胞中。在轉染之后，進行報告基因檢測實驗，比如熒光素酶檢測實驗。通過將上述轉染的結果與只轉染質粒載體的結果比較，確定miRNA模擬物和抑制劑的影響。
• 將miRNA的模擬物/抑制劑轉染到細胞中，然后檢測相關的內源性基因（即所研究的miRNA分子的靶標）的表達。通過將結果與未轉染的細胞或者轉染了陰性對照的細胞的表達結果相比，可以確定miRNA模擬物/抑制劑的作用。由于miRNA通常抑制目標基因的翻譯，而不降解目標基因的轉錄本，因此，一般通過檢測蛋白的表達水平來確定基因的表達水平，比如通過蛋白質印跡法。這意味著miRNA模擬物/抑制劑的影響通常不能通過定量的real-time PCR 來檢測。

siRNA

小干擾RNA（通常稱做siRNA）參與多種生物學過程——最常見的是RNA干擾或者RNAi。

大多數RNA是單鏈的，但是，siRNA由兩條互補的核酸鏈組成，與DNA類似。siRNA的長度大約為20–25個核苷酸。siRNA在RNAi過程中扮演了重要角色，它們通過互補的核苷酸序列來干擾特定基因的表達。

長度為21個核苷酸的雙鏈siRNA分子的一些近似值：

• 20 µM的siRNA相當于濃度大約為0.25 µg/µl
• 長度為21個核苷酸的siRNA的分子量大約為13–15 µg/nmol

RNAi

RNA干擾（或者RNAi）是細胞中的一種自然發生的過程，它能夠關閉或者沉默特定基因的活性。RNA干擾于1998年被發現，現在已經是研究基因功能的強大工具。

RNAi通過干擾信使RNA（mRNA）所攜帶的信息發揮作用，從而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。

誘導RNAi的雙鏈RNA分子（siRNA），在進入細胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。這些小的片段，作為引導物，引導siRNA與具有互補序列的mRNA相結合。然后，這些細胞內的mRNA被切割，從而有效地破壞了它們所攜帶的信息，并且沉默相應基因的表達。

RNAi的過程相當復雜。雙鏈RNA被RNase III識別，然后切割成21–23個核苷酸大小的siRNA分子。這些siRNA分子參與組成了稱做RISC（RNA-induced silencing complex，RNA 誘導的沉默復合物）的RNAi靶標復合物，這些復合物能夠破壞與siRNA同源的mRNA分子。靶標mRNA分子在其與siRNA分子序列互補區域的中心處被切割，然后導致靶標mRNA分子被降解，降低了蛋白的表達。

使用siRNA

siRNA分子是RNAi過程中的主要效應因子，可以通過化學方法或者酶催化的方法在體外合成。siRNA的序列設計對于有效的基因沉默是非常關鍵的，它們的設計方法是基于對RNAi過程的理解，以及對天然存在的siRNA分子的功能的理解，開發出來的。

siRNA的輸送對于基因沉默實驗是至關重要的。合成的siRNA分子可以通過電穿孔或者親脂的試劑，輸送到細胞內。但是，這兩種方法都是暫時的。質粒系統能夠用于表達短發卡RNA（shRNA）分子，它們是Dicer酶的底物，在體內能成熟成為siRNA分子。這樣的系統能穩定地抑制目標基因的表達。也有一些病毒輸送系統，能夠將shRNA輸送到難于轉染的細胞系中。

RNAi實驗原理及流程

以上信息來源于QIAGEN官網：http://www.qiagen.com/cn/resources/molecular-biology-methods/rna/