質粒純化方案中的關鍵步驟

如今質粒純化不再是什么難題，那么做了這么次質粒抽提的你了解質粒純化的原理嗎？你知道哪些步驟對質粒純化的成功起著關鍵作用嗎？

QIAGEN質粒抽提簡單原理：

在堿性條件下裂解細菌之后，將裂解液以指定的鹽濃度加入QIAGEN-tip當中。質粒DNA將發生選擇性的結合而從RNA、蛋白質及其他細胞污染物中被分離出來。

1、制備細胞裂解產物 

細胞產率很大程度上依賴于細胞裂解質量。因此制備澄清的細胞裂解產物是QIAGEN純化方案中的重要一環，QIAGEN已經仔細針對最優的裂解條件進行了相關的專業設計。 

對培養物進行收獲和重懸之后，在RNase A存在的條件下使用NaOH-SDS（P2緩沖液）裂解細菌細胞。SDS溶解了細胞膜中的磷脂和蛋白成分，導致細胞裂解并釋放出內容物。NaOH則對染色質和質粒DNA以及蛋白質進行變性。最優化的裂解時間能夠讓細胞中釋放出最多的質粒DNA，卻不會釋放出與細胞壁結合的染色體DNA，從而使得質粒暴露于變性條件下的時間達到最小。堿性處理的時間過長可能導致質粒DNA形成無法恢復的變性狀態。這一狀態的質粒在瓊脂糖凝膠中移動得更快，并且能夠抵抗限制性內切酶的降解。隨后通過加入酸性的醋酸鉀（P3緩沖液）對裂解液進行中和。高的鹽分會導致KDS*發生沉淀，變性蛋白、染色體DNA和細胞碎片隨之被鹽——去垢劑復合物所俘獲。而質粒DNA由于其更小的體積和共價閉合性，得以重新正確地復性并存留于液相之中。由于裂解液中任何殘存的SDS都會抑制DNA與QIAGEN樹脂的結合，所以裂解液必須緩慢而徹底地進行混合，確保去垢劑完全沉淀。 

*十二烷基硫酸鉀。 

從染色體DNA中分離質粒的原理主要基于細胞壁結合的染色體DNA與鹽分、去垢劑和蛋白的不溶復合物之間的共沉淀效應。質粒DNA則仍存留于上方澄清的液相當中。裂解過程中的劇烈處理將會切斷細菌染色體，導致上清液中發生染色體DNA碎片的污染。后續的反應條件將無法在化學上區分質粒DNA與染色體碎片，因此這兩種成分將不會被QIAGEN樹脂分離，進而在相同的鹽濃度下被一同洗脫下來。在實驗開始時加入的RNase A能夠有效降解堿裂解過程中釋放出的RNA成分。隨之產生的RNA片段在裂解液所處的鹽濃度和pH條件下不會與QIAGEN樹脂結合。沉淀物殘片通過離心，或QIAfilter Cartridge的使用得以去除，所生成的清亮裂解液可直接載入QIAGEN-tip中。這一階段中溶菌液的清澈對于保證液相的良好流動性十分重要，最終也將保障獲得完全去除蛋白質的DNA產物。 

2、使用QIAfilter Cartridge澄清細菌裂解液 

QIAfilter Cartridge是一類特殊的過濾裝置，專為替代細菌堿裂解產物的離心步驟而設計。獲得培養物沉淀后，細菌細胞在NaOH-SDS中得以裂解，并添加酸性醋酸鉀參與中和，隨后直接進入QIAfilter Cartridge中進行孵育。裂解液只需數秒鐘便可通過過濾器，隨之獲得澄清的液相。在中和反應中形成的，包含染色體DNA、鹽類、去垢劑和蛋白質的不溶復合物在此過程中被完全出去。QIAfilter Cartridge對于細菌裂解產物的凈化作用相比傳統離心法更為有效。此外，通過離心無法凈化的小型SDS沉淀也可通過QIAfilter Cartridge完全除去。 

3、QIAGEN-tip中DNA的結合和洗滌 

清亮裂解液被載入預先平衡好的QIAGEN-tip當中，通過重力流動完成結合反應。裂解液的鹽分和pH條件與QIAGEN樹脂的優異選擇性一起，確保了質粒DNA結合的特異性，降解后的RNA、細胞蛋白和代謝物則不會發生結合而隨液相流出。進一步使用中鹽緩沖液（QC緩沖液）洗滌QIAGEN-tip，以去除如痕量RNA和蛋白質（例如RNase A）等任何形式的污染物殘留，該過程不會對質粒DNA的結合造成任何影響。QC緩沖液同時也會打斷非特異性的相互作用，無需引入苯酚即可去除核酸結合蛋白。洗滌緩沖液中低濃度的酒精會消除非特異性的疏水性相互作用，從而提高所結合DNA的純度。自此之后，質粒DNA被高鹽緩沖液（QF或QN緩沖液）從QIAGEN-tip上有效洗脫下來。 

4、通過離心實現脫鹽和濃縮 

洗脫的質粒DNA通過異丙醇沉淀進行脫鹽和濃縮。在室溫下進行沉淀反應以最大程度地減小鹽分的共沉淀效應。在離心之后，使用70%乙醇對DNA沉淀進行洗滌，以去除殘留的鹽分；同時以更易揮發的乙醇替代異丙醇，是為了方便在后續去除液相。純化后的DNA經簡單的空氣干燥步驟和小體積pH8.0的TE緩沖液或pH8.5的Tris•Cl的重新溶解，即可用于轉染、測序、標記、克隆，以及任何其他的實驗操作。 

5、使用QIAprecipitator Module進行脫鹽和濃縮 

將洗脫得到的質粒DNA與異丙醇進行混合后，使用注射器將其加入試劑盒中的QIAprecipitator Module。該模塊能夠捕獲異丙醇液體混合物中的DNA沉淀。推薦使用乙醇進行額外的洗滌步驟，最大程度地提升DNA的純度。QIAprecipitator得到的DNA沉淀形成了薄層結構，通過使用注射器簡單推動，即可使空氣流經QIAprecipitator，在去除酒精的同時實現了DNA的充分干燥。之后使用試劑盒提供的TE緩沖液將DNA從QIAprecipitator洗脫至一個微量離心管中。任何常用的緩沖液或水均可作為替代物進行洗脫。如用純水洗脫，則DNA應儲存于–20°C的溫度條件之下，因為DNA在缺乏緩沖系統及螯合劑的條件下會發生降解。這樣獲得的DNA產物適于進行轉染、測序、標記、克隆，以及其他任何的后續應用。

以上信息來源于QIAGEN：

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/key%20steps%20in%20the%20plasmid%20purification%20protocols/