技術簡介
真核生物全轉錄組測序的研究對象為特定組織或細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括 mRNA, LncRNA和環狀RNA 。常規的轉錄組分析僅通過Oligo(dT)法對mRNA進行富集和分析，會導致包括環狀RNA和相當比例的LncRNA丟失，無法準確，全面的反映真實的轉錄組信息。云序生物轉錄組測序服務采用最優的樣品預處理和建庫方案，能夠同時檢測樣品中的mRNA，LncRNA和環狀RNA, 獲取最全面的轉錄組信息，進而針對不同類型的RNA進行表達分析，結構研究，變異研究以及全新轉錄本的發現。
云序優勢
全面的檢測所有類型的RNA：
常規的轉錄組測序采用Oligo d(T)法純化帶Poly(A)尾巴的RNA分子。然而很多熱門的RNA分子，如環狀RNA和部分LncRNA，沒有Poly(A)尾巴，因此在處理過程中會被丟失掉。云序生物擁有市面上最全的，針對不同物種的去rRNA試劑盒，能夠全面保留所有類型的RNA信息
適用于降解樣品：
云序生物采用特有的，可適用于降解樣品的試劑盒，能夠最大程度的保留降解樣品中的RNA信息。尤其適合于臨床樣品的轉錄組檢測
鏈特異性檢測：
很多基因位點會生成轉錄方向相反的、具有重要調控功能的反義RNA。常規的建庫方法無法區分這些反義RNA，而云序生物采用鏈特異性的建庫方法，可以準確檢測反義RNA，從而提供更全面的轉錄組信息
一站式服務：
客戶只需提供細胞，組織，體液或總RNA，云序生物為您完成從樣品準備，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程
專業化的生物信息分析：
云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求
樣本要求
樣品類型：
組織、細胞、體液、總RNA。其它類型樣品請詳詢。
樣品量：
a) 細胞 2×107
b) 組織100 mg
c) 體液：全血、血清、血漿 2-3 mL
腦脊液 5ml
尿液 50ml
d) 總RNA 2μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾 ）
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mLEppendorf管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。
數據分析
1、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA篩選
根據高通量測序結果，篩選出（Fold Change≥2， P值≤ 0.05）差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA。
注：Fold Change代表差異程度，P值代表差異的顯著性，篩選中采用的倍數變化會根據具體數據情況進行調整。
2、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA的聚類
3、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA的GO和信號通路分析
對差異mRNA/環狀RNA/LncRNA的來源基因進行功能和信號通路富集分析，以便推斷mRNA/環狀RNA/LncRNA的功能。
4、LncRNA-mRNA共表達網絡（CNC網絡）構建
利用LncRNA與mRNA的共表達關系，構建LncRNA-mRNA共表達網絡圖，幫助發現LncRNA的靶基因，并推斷LncRNA的功能
5、競爭性內源RNA（ceRNA）分析
通過circRNA-miRNA相互作用網絡分析，可以幫助解析作為miRNA海綿發揮作用的環狀RNA的功能以及作用機制。
6、circRNA-miRNA-gene網絡構建
一些LncRNA可以通過與miRNA結合，調節miRNA靶基因的表達。通過LncRNA-miRNA-mRNA關聯分析，可以幫助推斷作為miRNA海綿發揮作用的LncRNA以及作用機制。
案例解析
案例1：前列腺癌的全轉錄組分析
RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifis recurrent gene fusions,cancer-associated long noncoding RNAs and aberrantalternative splicings, Ren et al. Cell Res,2012
RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifis recurrent gene fusions,cancer-associated long noncoding RNAs and aberrantalternative splicings, Ren et al. Cell Res,2012
本文通過轉錄組測序分析了14對前列腺癌組織和相應的癌旁組織，發現在不同的前列腺癌樣品中在基因融合，lncRNA表達，可變剪切和點突變等方面均存在著巨大的差異。在這14個前列腺癌樣品中，有3個（21.4%）存在著TMPRSS2-ERG基因融合。通過擴大樣品量，還發現了2個新的基因融合CTAGE5-KHDRBS3和USP9Y-TTTY15。此外，通過表達分析發現了許多LncRNA在前列腺癌中差異表達。LncRNA和mRNA的表達相關性分析表明：LncRNA可能不僅僅在轉錄過程中發揮基因調控作用。
圖1. 三個前列腺癌樣品中的TMPRSS2-ERG 基因融合
圖2. LncRNA與蛋白編碼基因的表達相關性熱圖
圖3. 前列腺癌的基因組不同位置上的體突變分布
圖4.14個前列腺癌樣品中的可變剪切事件的基因組圖譜
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