論文解讀：HD-MEA技術(shù)用于長(zhǎng)時(shí)期追蹤3D類器官電生理功能的案例分享

高密度微電極陣列（HD-MEA）相比傳統(tǒng)電生理（如膜片鉗）或低密度微電極陣列，具備三大核心優(yōu)勢(shì)：
🔷 長(zhǎng)期、高通量、非侵入式監(jiān)測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)整體活動(dòng)；
🔷 高時(shí)空分辨率捕捉單細(xì)胞乃至亞細(xì)胞（軸突）水平的電信號(hào)及其傳播；
🔷 結(jié)合電活動(dòng)進(jìn)行功能成像，間接獲取網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫畔ⅰ?br />
本次論文解讀分享一個(gè)利用HD-MEA高時(shí)空分辨率解析復(fù)雜生理過程和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)變化獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的典型研究案例，供大家參考。

研究論文的標(biāo)題為“Development of an innervated human skin equivalent to model nociceptive circuitry in vitro”，由意大利技術(shù)研究院（IIT）Paolo Antonio Netti教授研究團(tuán)隊(duì)于2025年10月31日在《Biomaterials》期刊（IF₂₀₂₄=12.8）上線。

研究成功開發(fā)了一種可以培養(yǎng)在HD-MEA設(shè)備芯片上的神經(jīng)支配人皮膚等效物模型。該模型包含內(nèi)源性細(xì)胞外基質(zhì)、人施萬(wàn)細(xì)胞和分層表皮，可被大鼠背根節(jié)感覺神經(jīng)元完全支配，并形成神經(jīng)-上皮連接。HD-MEA記錄顯示，人皮膚等效物與背根神經(jīng)元的共培養(yǎng)使得背根神經(jīng)節(jié)的自發(fā)活動(dòng)顯著增強(qiáng)，且對(duì)表皮局部施加的傷害性刺激（辣椒素）產(chǎn)生具有時(shí)空特異性的強(qiáng)烈電生理響應(yīng)，成功在體外復(fù)現(xiàn)了體內(nèi)傷害感受信號(hào)從皮膚向感覺神經(jīng)元的完整傳導(dǎo)通路。

HD-MEA技術(shù)結(jié)合該模型，為體外研究傷害感受環(huán)路機(jī)制、評(píng)估新型鎮(zhèn)痛療法及構(gòu)建人源感覺疾病模型提供了一個(gè)功能強(qiáng)大的高分辨率電生理監(jiān)測(cè)平臺(tái)。

研究主要結(jié)果
本研究首先利用人成纖維細(xì)胞構(gòu)建富含內(nèi)源性細(xì)胞外基質(zhì)的人真皮等效物，并植入人施萬(wàn)細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，經(jīng)氣液界面培養(yǎng)形成分層表皮，獲得完整的人皮膚等效物。隨后，將成熟的大鼠背根節(jié)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（培養(yǎng)于HD-MEA上）與該皮膚模型共培養(yǎng)9天，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)支配。最后，結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫組化和HD-MEA電生理記錄，系統(tǒng)評(píng)估模型的神經(jīng)支配結(jié)構(gòu)、自發(fā)電活動(dòng)及對(duì)辣椒素刺激的傷害感受響應(yīng)。

1、構(gòu)建富含施萬(wàn)細(xì)胞、完全內(nèi)源性的神經(jīng)支配人皮膚等效物
研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了包含人成纖維細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞（human Schwann cell, HSC)）和角質(zhì)形成細(xì)胞的完全內(nèi)源性人皮膚等效物（innervated human skin equivalent, IHSE）（圖1）。H&E染色顯示真皮細(xì)胞外基質(zhì)致密，其中嵌有成纖維細(xì)胞。免疫熒光證實(shí)施萬(wàn)細(xì)胞（S-100陽(yáng)性）位于上皮下方和真皮層內(nèi)。經(jīng)氣液界面培養(yǎng)后，上皮完全分層和分化，角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)志物（基底層的角蛋白14、生發(fā)層的p63、棘層的角蛋白10和角質(zhì)層的兜甲蛋白）表達(dá)明確，表明表皮結(jié)構(gòu)完整且功能正常。
 

圖1：富含人施萬(wàn)細(xì)胞的人皮膚等效物的形態(tài)發(fā)生。
a) 生成HSC富集HSE的流程示意圖。
b) 成熟HSE在Transwell上的照片。
c) 上皮分化過程的詳細(xì)示意圖。
d) 上皮分化浸沒階段結(jié)束時(shí)HSE的H&E染色（左）和S-100/DAPI免疫標(biāo)記（右），顯示施萬(wàn)細(xì)胞位于角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮層之間。
e) ALI培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)HSE的H&E染色（左）和S-100/DAPI免疫標(biāo)記（右），顯示上皮完全分層，施萬(wàn)細(xì)胞位置。
f) ALI階段結(jié)束時(shí)HSE的免疫標(biāo)記，分別顯示角蛋白14（基底層）、p63（生發(fā)層）和角蛋白10（棘層）、以及兜甲蛋白（角質(zhì)層）。

2、大鼠背根節(jié)神經(jīng)元在培養(yǎng)過程中形成并收縮
將大鼠背根神經(jīng)節(jié)（rat dorsal root ganglion, R-DRG）神經(jīng)元接種于HD-MEA上培養(yǎng)13天（圖2）。第3天出現(xiàn)明顯神經(jīng)元簇，第8天出現(xiàn)神經(jīng)突觸連接，但第13天網(wǎng)絡(luò)面積顯著收縮。量化分析顯示：與第3天相比，第8天和第13天的簇大小分別減少了28%（0.72 ± 0.22）和33%（0.67 ± 0.16）；網(wǎng)絡(luò)面積在第3天為總MEA面積的0.78 ± 0.13，第8天為0.71 ± 0.11，第13天為0.55 ± 0.23，較第3天顯著減少24%。培養(yǎng)第13天時(shí)神經(jīng)元簇尺寸趨于穩(wěn)定，同時(shí)平均放電率達(dá)到峰值（0.62 ± 0.32 Hz），被確定為與HSE共培養(yǎng)的最佳起始時(shí)間點(diǎn)。
 

圖2：R-DRG感覺神經(jīng)元在HD-MEA系統(tǒng)上的網(wǎng)絡(luò)演化。
a) R-DRG神經(jīng)元在HD-MEA上成熟的流程示意圖。
b) 第3、8、13天神經(jīng)元在HD-MEA表面的立體顯微鏡圖像，顯示簇縮小和網(wǎng)絡(luò)面積收縮。
c) （左）歸一化的平均簇大��；（右）歸一化的平均網(wǎng)絡(luò)面積，定量證實(shí)收縮趨勢(shì)。
d) （左）玻片上R-DRG神經(jīng)元簇的明場(chǎng)圖像；（中）TRPV1和DAPI熒光成像；（右）β-微管蛋白-3和DAPI熒光成像，顯示神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的三維結(jié)構(gòu)及痛覺感受器標(biāo)記表達(dá)。

買 MEA設(shè)備，找禮智生物
本研究中使用的高密度微電極陣列（HD-MEA）設(shè)備由瑞士MaxWell Biosystems公司研發(fā)生產(chǎn)。HD-MEA技術(shù)在8.1 mm²芯片表面集成26,400個(gè)電極（密度3,259 electrodes/mm²，間距17.5 μm），將電信號(hào)采集的空間分辨率提升至亞細(xì)胞層級(jí)，可捕獲樣本的每一個(gè)神經(jīng)元電信號(hào)。不僅支持急性腦切片、視網(wǎng)膜組織等生物樣本的急性實(shí)驗(yàn)記錄，更支持體外培養(yǎng)神經(jīng)元、類器官、心肌細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程檢測(cè)。

禮智生物是MaxWell中國(guó)區(qū)獨(dú)家授權(quán)代理商，積累了豐富的高密度MEA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗(yàn)。歡迎聯(lián)系我們，了解這一技術(shù)的更多細(xì)節(jié)和資料�。�聯(lián)系方式見文末）
 

3、IHSE形態(tài)學(xué)特征證實(shí)神經(jīng)-上皮連接形成
免疫熒光和3D重建顯示，R-DRG神經(jīng)元的軸突成功穿過1毫米厚的HSE真皮層，到達(dá)表皮層，并形成分支（圖3-4）。在表皮層中檢測(cè)到β-微管蛋白-3信號(hào)，深度可達(dá)100微米，表明神經(jīng)末梢已到達(dá)上皮。觀察到神經(jīng)末梢在接近表皮時(shí)分支成更細(xì)的末端，形態(tài)類似體內(nèi)游離神經(jīng)末梢（free nerve endings-like structures, FNELS)）。在橫切面中，β-微管蛋白-3信號(hào)清晰地出現(xiàn)在真皮-表皮連接處和真皮內(nèi)部，證實(shí)了神經(jīng)突在真皮內(nèi)的生長(zhǎng)以及與表皮的連接。S-100標(biāo)記證實(shí)施萬(wàn)細(xì)胞也浸潤(rùn)到HSE真皮層中。

圖3：與HD-MEA集成的IHSE的形態(tài)學(xué)特征。
a) HD-MEA上IHSE的照片，標(biāo)出觀察區(qū)域。
b) 三個(gè)觀察區(qū)域的示意圖。
c) 從頂端開始的IHSE上部95微米Z掃描（左）及綠色信號(hào)深度編碼（右），顯示神經(jīng)元標(biāo)記從深層到達(dá)表層。
d) IHSE側(cè)面132微米深度的Z掃描（左）及綠色信號(hào)深度編碼（右），顯示支配性神經(jīng)突向頂端分支形成FNELS。

圖4：神經(jīng)支配HSE橫切面的共聚焦和多光子成像。
a) 分析樣本橫切面的示意圖。
b, c) β-微管蛋白-3/DAPI免疫標(biāo)記及SHG膠原成像，顯示真皮內(nèi)和真皮-表皮連接處的神經(jīng)突（類似FNELS）。
d, e) S-100/DAPI免疫標(biāo)記及SHG膠原成像，證實(shí)施萬(wàn)細(xì)胞位于真皮-表皮連接處和真皮層內(nèi)。
f, g, h) 另一樣本的β-微管蛋白-3/DAPI免疫標(biāo)記，進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)突存在于真皮層并接近上皮角質(zhì)形成細(xì)胞核，形成神經(jīng)-上皮連接。

4、IHSE表現(xiàn)出顯著高于2D培養(yǎng)的自發(fā)電活動(dòng)
電生理記錄顯示，IHSE共培養(yǎng)顯著增強(qiáng)了神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)性活動(dòng)（圖5-6）。在共培養(yǎng)第3、6、9天（對(duì)應(yīng)總培養(yǎng)第16、18、22天），IHSE模型的平均放電率（分別為1.00 ± 0.27 Hz， 0.80 ± 0.18 Hz， 0.72 ± 0.20 Hz）均約為對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)2D DRG培養(yǎng)（0.48 ± 0.04 Hz， 0.34 ± 0.01 Hz， 0.47 ± 0.02 Hz）的2倍，差異顯著。同時(shí)，IHSE的活性電極面積也顯著增大（分別為2.5倍， 6.14倍， 5.07倍）。此外，利用Axon Tracking模塊提取的形態(tài)功能參數(shù)（如總軸突長(zhǎng)度從第11天的489.80 ± 169.33 μm顯著增加至第22天的3777.98 ± 1743.19 μm）表明HSE共培養(yǎng)促進(jìn)了軸突的生長(zhǎng)和網(wǎng)絡(luò)的成熟。

圖5：HSE對(duì)R-DRG神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)自發(fā)電活動(dòng)的影響。
a) （左）IHSE圖像與電生理活動(dòng)熱點(diǎn)疊加；（中、右）電極記錄簇的同步活動(dòng)和尖峰傳播示例。
b) （左）2D DRG模型與3D DRG+HSE模型平均放電率隨時(shí)間演化；（右）兩者活性面積隨時(shí)間演化，顯示HSE共培養(yǎng)顯著增強(qiáng)自發(fā)活動(dòng)。

圖6：HSE對(duì)R-DRG神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)自發(fā)電活動(dòng)的影響——形態(tài)功能分析。
a) 第11、16、18、22天Axon Tracking分析圖像，顯示檢測(cè)到的軸突。
b) Axon Tracking圖像與IHSE顯微鏡圖像疊加，證實(shí)檢測(cè)到的活性神經(jīng)元與HSE接觸。
c-f) 檢測(cè)到的神經(jīng)突在傳導(dǎo)速度、分支長(zhǎng)度、距起始點(diǎn)最長(zhǎng)距離和最長(zhǎng)潛伏期方面的分布直方圖。

5、IHSE對(duì)辣椒素刺激表現(xiàn)出特異性傷害感受響應(yīng)
在IHSE表皮頂端局部施用50 μM辣椒素溶液，可誘發(fā)特異性時(shí)空電響應(yīng)（圖7-8）。MEA記錄顯示，給藥后神經(jīng)元放電率立即增加，平均放電率在給藥后初期（0-300秒）比自發(fā)活動(dòng)高出70%（P < 0.01），同時(shí)活性通道數(shù)增加13%（P < 0.05）。放電率在給藥后300-600秒內(nèi)仍保持高位（比自發(fā)活動(dòng)高63%， P < 0.001）。然而，在給藥600-900秒后，放電率和活性通道數(shù)均急劇下降（放電率降低52%， 活性通道數(shù)減少65%， P < 0.01）。對(duì)照實(shí)驗(yàn)（共培養(yǎng)僅24小時(shí)，未形成充分神經(jīng)支配）顯示，辣椒素局部給藥后響應(yīng)延遲（約300秒后）且幅度顯著低于成熟IHSE（P < 0.05），而全身給藥雖立即響應(yīng)但持續(xù)時(shí)間短。這證實(shí)了成熟IHSE中功能性神經(jīng)-上皮連接對(duì)于完整傷害感受傳導(dǎo)的重要性。

圖7：IHSE對(duì)辣椒素誘發(fā)的傷害感受電活動(dòng)響應(yīng)。
a) 辣椒素局部給藥的實(shí)驗(yàn)示意圖。
b) 單個(gè)電極記錄的軌跡，顯示給藥后尖峰數(shù)量立即增加。
c) 檢測(cè)到的尖峰波形，呈樹突區(qū)特征的正向尖峰。
d) 所有電極檢測(cè)到的尖峰數(shù)隨時(shí)間演化示例圖，顯示給藥后尖峰數(shù)驟升并持續(xù)約600秒后下降。
e) 對(duì)應(yīng)樣本的通道活動(dòng)點(diǎn)陣圖，顯示給藥后新通道激活，隨后通道失活。
f, g) 按300秒間隔統(tǒng)計(jì)的平均檢測(cè)尖峰數(shù)和平均活性通道數(shù)條形圖，量化顯示給藥后的顯著增強(qiáng)及后期的抑制。

圖8：辣椒素誘發(fā)活動(dòng)期間通道的映射、分類和定量。
a) 辣椒素給藥后的參考時(shí)間軸，定義自發(fā)活動(dòng)（SA）、早期誘發(fā)活動(dòng)（EA）、中期誘發(fā)活動(dòng)（MA）和晚期誘發(fā)活動(dòng)（LA）。
b) IHSE圖像、活性神經(jīng)元簇的Axon Tracking及辣椒素實(shí)驗(yàn)中記錄電極位置的疊加圖。
c) 圖b黑色框區(qū)域的放大，顯示電極活動(dòng)狀態(tài)變化（紅色：新激活；藍(lán)色：失活；灰色：持續(xù)激活）。
d) 各時(shí)間間隔比較的矩陣，顯示平均激活電極數(shù)、持續(xù)活性電極數(shù)和失活電極數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差。

研究總結(jié)
本研究首次將先進(jìn)的HD-MEA電生理平臺(tái)與復(fù)雜的神經(jīng)支配人皮膚等效物模型相結(jié)合。HD-MEA技術(shù)的引入，使得研究者能夠以亞細(xì)胞分辨率、長(zhǎng)期（數(shù)天至數(shù)周）、同時(shí)記錄數(shù)百個(gè)位點(diǎn)的電活動(dòng)。

首先，高密度與非侵入性使其能長(zhǎng)期（超過20天）穩(wěn)定記錄整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)和誘發(fā)活動(dòng)，避免了膜片鉗的機(jī)械損傷和單次記錄局限。其次，高時(shí)空分辨率使其能精確定位辣椒素刺激后電活動(dòng)的起源和傳播路徑，首次在3D皮膚模型中可視化了傷害信號(hào)從表皮向神經(jīng)元的傳遞過程。再者，其高通量并行記錄能力（同時(shí)監(jiān)測(cè)上千個(gè)位點(diǎn)）提供了全面的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)視圖，量化了共培養(yǎng)后放電率、活性面積及軸突參數(shù)的全局性變化，有力證明了HSE對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)制作用。最后，電信號(hào)驅(qū)動(dòng)的形態(tài)分析功能（Axon Tracking）在組織不透明的情況下，依然能提取出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵形態(tài)參數(shù)，體現(xiàn)了其功能與形態(tài)分析結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，HD-MEA是將復(fù)雜3D組織模型的功能分析提升到高時(shí)空動(dòng)態(tài)解析水平的理想工具。

參考文獻(xiàn)
Bellantoni D, Casale C, Mazio C, et al. Development of an innervated human skin equivalent to model nociceptive circuitry in vitro. Biomaterials. 2025 Oct 31;328:123808. doi: 10.1016/j.biomaterials.2025.123808.