脂質納米顆粒制劑中的mRNA-free LNPs(空殼LNPs)的結構特征及其影響
脂質納米顆粒（LNPs）已經成為mRNA傳遞的通用平臺，在一系列應用中得到應用，包括疾病預防、癌癥免疫治療和基因編輯。典型的LNPs配方由可電離的陽離子脂質、輔助脂質、膽固醇和聚乙二醇(PEG)四種脂質組成，這些成分在穩定性、結構、包封效率以及體內外相互作用中都發揮著至關重要的作用。負載了核酸的LNPs的內部結構和表面形態會隨著脂質成分的不同而產生變化，從而影響終產品的穩定性和治療效果。
近日，上海交通大學陳曉霞、哈爾濱醫科大學劉卓等在《Journal of Controlled Release》上發表題為“Structural characterization of mRNA lipid nanoparticles (LNPs) in the presence of mRNA-free LNPs”的研究論文。
該研究針對一個長期被忽視卻具有重要意義的問題：mRNA-LNP制劑中存在大量mRNA-free LNPs（即未載mRNA的空殼顆粒）提出了解決方案，并建立了更為精確的mRNA-LNP結構模型。
mRNA-LNPs內的脂質分布至關重要，這是制備和功效的關鍵因素。然而，最近的研究結果表明，通過商業微流體技術制備的mRNA-LNP樣品可能含有相當一部分不含mRNA的LNP，作者使用納米流式細胞術量化mRNA-LNP樣品中無mrna LNPs的比例高達30%。
本文采用對比變換小角中子散射（contrast variation SANS）技術，結合納米流式細胞術（NanoFCM），定量解析了mRNA-free LNPs的存在比例，并在此基礎上提出了剔除空顆粒干擾后的mRNA-loaded LNPs結構表征方法。
一、mRNA-free和mRNA-LNP樣品的基本表征
作者使用Moderna脂質配方（SM-102 : DSPC : Chol : PEG = 50 : 10 : 38.5 : 1.5）和2856個核苷酸長度的mRNA制備的LNP樣品中，mRNA-free顆粒的比例約為27.7%。通過SANS與VSANS技術對mRNA-free LNPs進行結構解析，建立了其core-shell橢球模型。進一步，將包含mRNA的樣品（即raw mRNA-LNPs）中空殼LNPs的散射信號剔除，得以首次實現對mRNA-loaded LNPs的純凈結構信號分離與建模。
圖1 無mrna lnp和原始mRNA-LNP樣品的基本特征
二、mRNA-free的結構表征
LNPs在mRNA疫苗中具有雙重作用，既可作為增強免疫效果的佐劑，又可能成為免疫原引發不良反應。因此，在空載LNPs顯著存在的情況下，了解LNPs的結構對于闡明mRNA疫苗的藥代動力學和生物分布至關重要。作者采用超小角中子散射(very small angle neutron scattering, VSANS)技術來表征空載LNPs的結構，將mRNA-free樣品懸浮在不同比例的D2O/H2O溶劑中(圖2a)，收集VSANS數據，確定LNP核心和殼層內的脂質分布。根據VSANS數據擬合結果，提出了mRNA-free的核心-殼層結構模型(圖2b），詳細確定了核心和殼層的體積分數、溶劑含量及脂質組成等參數。
圖2 無mrna LNPs的VSANS結構表征
該研究不僅給出了mRNA-loaded與mRNA-free LNPs的結構模型，還指出了結構解析方法的適用邊界：若mRNA-free LNPs占比不高（例如<30%），則原始樣品也可用于某些結構參數的分析（如殼厚、脂質組成）；但若需準確獲取核心大小、溶劑比例或mRNA負載量等信息，則必須定量剔除空殼顆粒的干擾。該原則為今后LNP結構研究提供了重要的技術指引。
此外，研究還推測mRNA-free LNPs因其核心更致密，在酸性環境下可能更容易與內體膜融合，有助于mRNA釋放，間接提升mRNA-loaded LNPs的轉染效率。另一方面，mRNA-loaded LNPs的高含水量則可能帶來更高的冷凍損傷風險和水解風險，提示儲存和穩定性策略需加以優化，如采用冷凍干燥。
總的來講，這項工作通過構建mRNA-free與mRNA-loaded LNPs的獨立結構模型，不僅糾正了此前結構研究中的關鍵偏差，還為今后mRNA疫苗、RNA藥物及載體開發提供了準確、高分辨率的結構基礎，并為質量控制和工藝優化提供了可量化的參數支撐。
