腫瘤/纖維化EMT研究中mIHC染色指標的組合及選擇方法
在選擇上皮間質轉化（EMT）和間質上皮轉化（MET）的多重免疫組化（mIHC）染色指標時，核心原則是同時標記上皮細胞標志物、間質細胞標志物及關鍵調控因子，通過多指標共定位分析，直觀呈現細胞表型轉化的動態過程（如上皮標志物丟失、間質標志物獲得，或反之）。以下從指標分類、組合策略、注意事項三方面詳細說明：
一、核心指標分類：上皮標志物、間質標志物、調控因子
1. 上皮細胞標志物（核心功能：指示上皮表型完整性）
用于識別細胞是否保留上皮特性，EMT過程中通常表達下調或丟失，MET過程中重新上調或恢復。
| 標志物 | 特異性與應用場景 |
| E-鈣黏蛋白（E-cadherin） | 上皮細胞間黏附連接的核心蛋白，EMT的“金標準”標志物之一，幾乎所有上皮源性組織均適用（如乳腺、肺、結直腸等）。 |
| 細胞角蛋白（Cytokeratins, CKs） | 上皮細胞骨架特異性蛋白，常用廣譜CK（如CKpan，覆蓋CK1/5/6/8/10/14/18/19）或組織特異性CK（如CK7/CK20區分消化道上皮），避免與間質細胞交叉反應。 |
| 緊密連接蛋白（Occludin/ZO-1） | 上皮細胞緊密連接組分，反映上皮屏障功能，適合研究EMT對組織屏障的破壞（如肺上皮、腎小管上皮）。 |
2. 間質細胞標志物（核心功能：指示間質表型獲得）
用于識別細胞是否獲得間質特性，EMT過程中表達上調，MET過程中表達下調或丟失。
| 標志物 | 特異性與應用場景 |
| 波形蛋白（Vimentin） | 間質細胞（成纖維細胞、內皮細胞、間充質細胞）骨架蛋白，EMT中最常用的間質標志物，與E-cadherin表達呈“負相關”，適合所有組織類型的EMT/MET檢測。 |
| N-鈣黏蛋白（N-cadherin） | 間質細胞（如成纖維細胞、平滑肌細胞）黏附蛋白，EMT中常與E-cadherin“切換表達”（E→N），尤其適用于腫瘤侵襲、轉移相關EMT（如乳腺癌、肺癌）。 |
| α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA） | 肌成纖維細胞特異性標志物，適合研究“肌成纖維細胞樣EMT”（如肺纖維化、肝纖維化中的上皮細胞→肌成纖維細胞轉化）。 |
| 纖維連接蛋白（Fibronectin） | 間質細胞外基質（ECM）成分，EMT中上皮細胞分泌增加，可輔助反映細胞外基質重構（如腎臟纖維化、腫瘤微環境）。 |
3. EMT/MET關鍵調控因子（核心功能：解釋表型轉化的分子機制）
用于定位調控EMT/MET的信號分子，明確“誰在驅動轉化”，通常與上皮/間質標志物共定位分析。
| 調控因子家族 | 代表分子 | 功能與應用場景 |
| 轉錄因子 | Snail、Slug、Twist1/2 | EMT核心轉錄抑制因子（直接抑制E-cadherin表達），腫瘤EMT、胚胎發育EMT的關鍵驅動因子，適合腫瘤侵襲前沿、纖維化病灶區域檢測。 |
| 生長因子受體 | TGF-βRⅠ/Ⅱ、EGFR | 上游信號受體（TGF-β是EMT經典誘導信號，EGFR促進腫瘤EMT），適合研究信號通路激活與EMT的關聯（如肺癌、結直腸癌）。 |
| 信號通路分子 | β-catenin（核定位） | Wnt通路關鍵分子，核定位的β-catenin可激活EMT轉錄因子，適合檢測“上皮細胞中β-catenin核轉位”（如結直腸癌、肝癌）。 |
二、mIHC指標組合策略：按研究目標設計“3-4指標組合”
mIHC的優勢是同時檢測多個指標，需根據研究對象（腫瘤/纖維化/胚胎發育）和核心問題（僅觀察表型？還是探究機制？）設計組合，避免指標過多導致信號重疊（通常一次檢測3-4個指標，選擇不同種屬來源一抗，搭配不同熒光素二抗）。
1. 基礎組合：僅觀察EMT/MET表型（無機制探究）
核心邏輯：上皮標志物 + 間質標志物（必選）+ 細胞定位對照（如DAPI染核），適合快速判斷“是否發生轉化”。
· 通用組合（所有組織）：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（間質）+ DAPI
→ 結果判讀：正常上皮細胞僅E-cadherin+，間質細胞僅Vimentin+；EMT細胞同時表達兩者（“雙陽性”）或E-cadherin-、Vimentin+；MET細胞則相反。
· 腫瘤特異性組合：CKpan（上皮）+ N-cadherin（間質）+ DAPI
→ 優勢：CKpan特異性識別腫瘤上皮細胞，避免與正常間質細胞混淆，適合腫瘤轉移灶的EMT檢測。
· 纖維化特異性組合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（肌成纖維細胞間質）+ DAPI
→ 適合肺/肝/腎纖維化中“上皮→肌成纖維細胞”轉化的檢測。
2. 進階組合：表型 + 機制探究（推薦）
核心邏輯：上皮標志物 + 間質標志物 + 調控因子 + DAPI，適合明確“調控因子是否驅動表型轉化”。
· 腫瘤EMT機制組合：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（間質）+ Snail（調控因子）+ DAPI
→ 結果判讀：若Snail核陽性的細胞同時出現E-cadherin下調、Vimentin上調，提示Snail驅動該區域EMT。
· TGF-β通路相關組合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（間質）+ TGF-βRⅡ（調控因子）+ DAPI
→ 適合纖維化研究，判斷TGF-β受體激活是否與上皮→肌成纖維細胞轉化相關。
三、關鍵注意事項
1. 一抗種屬與熒光素匹配：
mIHC可以選擇相同種屬來源的一抗；染色順序遵循先弱后強的原則（如CKpan這種泛表達指標可以放最后一輪搭配波長最長的TSA染料）
2. 組織特異性調整：
- 避免選擇與組織背景交叉的標志物（如肝臟中，CK18特異性標記肝細胞，而CKpan可能與膽管上皮交叉，需優先選CK18）；
- 間質豐富的組織（如肺、腎臟），可增加“內皮細胞標志物”（如CD31）排除內皮細胞干擾，明確Vimentin+細胞是否為EMT來源（而非正常內皮/成纖維細胞）。
3. 陽性對照與陰性對照：
- 陽性對照：已知發生EMT的組織（如腫瘤侵襲前沿、肺纖維化病灶）；已知MET的組織（如腫瘤轉移灶中分化較好的區域）；
- 陰性對照：正常上皮組織（僅上皮標志物+）、正常間質組織（僅間質標志物+），以及“一抗替代對照”（用同型IgG替代特異性一抗，排除非特異性染色）。
4. 結果量化指標：
僅觀察“陽性/陰性”不夠，需通過圖像分析軟件（如ImageJ、QuPath）量化：
- EMT細胞比例：（E-cadherin-Vimentin+細胞數 + E-cadherin+Vimentin+細胞數）/ 總上皮細胞數；
- 共定位系數：調控因子（如Snail）與間質標志物（如Vimentin）的共定位Pearson系數，判斷兩者是否協同表達。
綜上，EMT/MET的mIHC指標選擇需圍繞“表型識別（上皮 + 間質）+ 機制驗證（調控因子）”核心，結合研究對象調整組合，并嚴格控制對照與量化分析，才能準確反映轉化過程及分子機制。
小愛mIHC服務即染指標| 組織 | 人（免費提供抗體使用） | 小鼠（免費提供抗體使用） |
| T細胞 | CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103、CD69 | CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103、CD69 |
| 巨噬細胞 | CD68、CD163、CD206、CD86、M-CSF、CD14、CSF-1R | F4/80、CD68、CD86、CD11b、CD163、M-CSF、CD206、CSF-1R |
| 免疫檢查點 | PD-1、PD-L1、HLA-DR、TIM-3、GZMB、CD24、LAG-3、B7-H3/CD276 | GZMB、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3 |
| 神經細胞 | IBA1、GFAP、NeuN | IBA1、GFAP、NeuN |
| 成纖維細胞 | α-SMA | α-SMA |
| 腫瘤相關 | Ki-67、PANCK、VEGF、SHP-2、Arginase-1、EGFR、TTF-1、MUC1、p63、p40、CDX2、PCNA、EPCAM、GST-π、HER2、CK7、CK8、CK18、CK5/6、CK20、GATA-3 | SHP-2、Arginase-1、Ki-67、PANCK、PCNA、EPCAM、GST-π、EGFR、GATA-3 |
| NK細胞 | CD56、T-bet | NKR-P1C(NK1.1)、CD56、T-bet |
| B細胞（漿細胞） | CD20、CD21、CD23、CD19、CD24、CD80、CD138 | CD20、CD21、CD23、CD19 |
| 內皮細胞 | CD31、ICAM-1 | CD31 |
| 間充質細胞 | Vimentin | Vimentin |
| 細胞因子 | IL-4、IL-10、CXCL13、CCL2、TNF-α | TNF-α |
| 中性粒細胞 | CD66b、CXCR2、CD15 | LY6G、CXCR1、CXCR2 |
| 樹突狀細胞 | CD11b、CD11c | CD11b、CD11c |
| 更多指標 | Napsin A、Trem2 | Arrestin-C、iNOS、Trem2 |
