巨噬細胞機械免疫調節血管生成和成骨作用影響骨折愈合的再生環境

骨折愈合是一個復雜且高度協調的過程，包含連續且緊密相關的炎癥、修復和重塑階段。愈合級聯從炎癥階段開始，特征是形成止血并作為細胞臨時支架的纖維蛋白凝血塊，隨后是炎癥性免疫細胞的浸潤和募集，其中巨噬細胞（Mφs）已知在免疫反應中發揮長期作用。當 Mφs 進入受損組織時，會遇到高度炎癥信號，誘導其進入主要的“促炎”M1樣表型，驅動促炎細胞因子的釋放（包括IL-6、IL-8、TNF-α），這些細胞因子同時在骨折愈合過程中協調下游再生過程。持續的炎癥會導致愈合受損或延遲，因此，成功度過炎癥階段高度依賴于從M1樣表型向“抗炎”M2樣表型的嚴格調控轉換。這一 M2 轉換與修復期的進展相吻合，Mφs 分泌如抗炎細胞因子 IL-10 等因子，在成骨/軟骨生成譜系的后續調控中起關鍵作用。由于 Mφs 在骨折愈合的所有階段都具有關鍵的時間作用，因此，在早期纖維蛋白血腫中實現免疫調節是促進再生的有希望的新途徑。

骨骼修復的一個強有力調節因子是機械負荷（骨碎片間應變），它可能作用于早期骨折血腫來調節免疫環境。重要的是，數據表明早期機械線索對長期愈合反應起關鍵作用，因為骨折后第一周施加的應變大小與長期骨再生呈顯著正相關。這表明早期血腫的機械環境是通過潛在地影響免疫反應來調節愈合的關鍵因素。事實上，免疫反應受組織微環境信號控制，例如在許多疾病狀況、炎癥狀態以及衰老背景下觀察到的生物物理性質變化。然而，目前尚不清楚機械介導的 Mφ 表型變化是否通過間接影響早期血管形成和后期骨骼修復來影響再生環境。

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機械力學-免疫學領域的研究正在興起，旨在探討機械線索如何塑造免疫細胞表型和功能。最近，來自愛爾蘭圣三一大學生物醫學工程中心及先進材料與生物工程研究中心（AMBER）的團隊首次設計并驗證了一種復制早期骨折血腫部位動態負荷條件的專用 3D 體外平臺，通過表征 Mφ 表型、分泌組及可溶性因子對血管形成和成骨的影響來評估巨噬細胞對不同水平壓縮應變的反應，并研究了如何利用局部力學來調節高度炎癥環境以促進更有利于長期愈合的再生環境。研究成果發表于 Acta Biomaterialia 期刊題為“Mechano-immunomodulation of macrophages influences the regenerative environment of fracture healing through the regulation of angiogenesis and osteogenesis”。

首先，通過在不同染色強度的循環壓縮刺激下，對已建立的 M1/M2 樣及再生巨噬細胞相關標記進行基因和蛋白質表達分析，解析巨噬細胞表型調控。綜合來看，結果支持人類巨噬細胞具有機械反應性，對負荷強度敏感，反應在表型和分泌組的變化。值得注意的是，最低幅度 5% 的應變代表了固定良好的骨缺損，通常在臨床上表現出更好的愈合效果，能夠促進再生細胞因子 IL-10 的產生，同時抑制促炎 IL-6 因子的分泌。較高的35% 應變代表未修復缺陷和愈合不良，導致分泌組再生能力較低，VEGF-A 和 IL-10 水平下降。

缺損部位血管的浸潤發生在骨沉積之前，是骨愈合成功的關鍵。重要的是，巨噬細胞已知是血管形成的調節者，而血管形成高度依賴于其表型。因此，隨后確認了在巨噬細胞條件培養基（CM）存在下差異極化巨噬細胞對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）形成管狀結構能力的基線效應（圖1 B）。雖然與陰性對照組相比，M0 樣巨噬細胞 CM 未改變血管形成結果，但 M1 樣巨噬細胞 CM 導致連接、節點和分支的形成增加，M2a 樣 CM 進一步增強。這些結果與巨噬細胞中分別通過啟動血管形成和促進血管成熟的 M1 樣和 M2 樣表型的血管生成作用相符。

此外，研究了負荷巨噬細胞分泌組在決定管形成中的影響。高幅度 20–35% 機械負荷巨噬細胞 CM 時，HUVECs 重組明顯減少（圖1 A）。這一趨勢經定量驗證，與靜態對照相比，暴露于低 5% 應變的巨噬細胞未改變形成的連接、節點或分支數量，但暴露于高 20% 應變導致連接、節點和分支數量的顯著抑制，最高 35% 應變也出現類似趨勢（圖1 B）。這些數據表明，機械激活的巨噬細胞分泌旁分泌因子，以強度依賴性方式對血管生成產生負面影響，更高的壓縮負荷會誘發抑制性血管生成巨噬細胞分泌組，從而可能延遲或損害骨骼早期愈合階段。

圖1     機械激活的巨噬細胞分泌旁分泌因子，以強度依賴性的方式對血管生成產生負面影響。

接下來，探討了巨噬細胞分泌的旁分泌因子在不同壓縮強度下是否以及如何改變人骨髓來源間充質干細胞/基質細胞（MSCs）的成骨分化。有趣的是，與靜態對照相比，雖然較低的負荷（5%、20%）似乎對 RUNX2 成骨標志物的 mRNA 水平沒有影響（圖2 A），但較高的 35% 負荷則使其顯著增加1.62倍，與 M2a 表型相當。此外，由于機械壓縮后 SOX9 軟骨生成標志物表達未發生變化，導致 RUNX2/SOX9 比值以幅度依賴的方式增強，與靜態對照相比，35% 負荷巨噬細胞分泌組的 RUNX2/SOX9 比率顯著增加1.63倍，這符合 M2a 極化后的趨勢，表明成骨潛力增強。在檢測 BMP-2 mRNA 水平時，這一點得到了進一步的支持（圖2 A），其中 BMP-2 的表達以幅度依賴的方式顯著降低。

為了進一步驗證和補充上述發現，進行了 14 天礦化試驗評估了負荷巨噬細胞分泌組對 hMSCs 長期成骨作用的影響。首先觀察到 hMSC 增殖和 ALP 活性均無顯著變化，但有趣的是，巨噬細胞無論表型如何，在14天后都會分泌顯著抑制 hMSC 礦化的因子。此外，機械刺激 M0 巨噬細胞導致旁分泌因子的分泌，進一步抑制長期成骨，在較高的 20–35% 負荷下達到顯著水平，與靜態對照組相比鈣沉積分別降低 81% 和 84%（圖2 B–C）。這一下降趨勢與 M1 樣礦化結果相符，而 M1 型已已知對長期骨沉積有害。

這些發現共同指向MSCs中早期骨生成信號的強力調控，最終通過調節巨噬細胞分泌組抑制后期骨沉積，尤其是在高強度壓縮應變后。

圖2    機械激活的巨噬細胞分泌旁分泌因子，以強度依賴性的方式介導成骨。

既然機械刺激可以以幅度依賴的方式調節 M0 樣巨噬細胞的免疫反應，進一步關注的是是否可以利用局部力學來抑制代表受損骨缺損的高度炎癥免疫環境（圖3 A）�；�于上述在未活化巨噬細胞中建立再生混合表型/分泌組的研究，以下實驗選擇了中等幅度的 5% 壓縮應變。通過研究編碼 M1 和 M2 樣表型的基因表達，發現在 5% 壓縮應變下 M1 樣基因 CD80、CXCL9、CXCL10 和 CCR7 表達增強（圖3 B），同時 MRC1 M2 標志物也增加（圖3 C）但不顯著。值得注意的是，IL-10 mRNA 表達水平未因負荷而改變。這表明，將 M1 極化巨噬細胞暴露于適度的 5% 預負荷下，誘導其向 M1/ M2 樣表型的混合轉變，盡管偏向于促炎表型，這與之前的 M0 研究中發現的結果一致，即較低負荷激活了 M0 樣巨噬細胞的混合表型。在蛋白質水平上，機械刺激下 CD80 M1 和 CD206 M2 樣細胞表面標記均上調，進一步證實了這一點（圖3 D-E）。

隨后，試圖考察所得的混合表型是否與 M1 極化巨噬細胞高度炎癥分泌組的調控對應。有趣的是，盡管炎癥基因有所增加，但中等 5% 的預負荷水平相比靜態對照組減少了炎癥細胞因子的分泌，如促炎 IL-6 因子、TNF-α 因子顯著下降（圖3 F），這符合再生性 M2a 表型的趨勢。值得注意的是，與靜態對照相比，機械刺激下 IL-8 的產生沒有變化。而且這種促炎水平的調節并未以 IL-10 和 VEGF-A 促再生細胞因子的分泌為代價。這些發現凸顯了中度壓縮負荷在調節過度激活炎癥免疫反應方面的潛力，這通常發生在受損的骨缺損中。

圖3    中度壓縮應變可以改變高度炎癥性巨噬細胞的表型，從而抑制促炎巨噬細胞分泌組。

為了進一步探討局部力學在受損環境中指導骨愈合過程的作用，通過前述的管形成試驗評估了機械激活的 M1 極化巨噬細胞分泌組的血管生成再生特性。結果表明，在炎癥環境中，控制局部力學可以通過調節巨噬細胞分泌組重塑血管化，承受適度負荷，血管的再生能力增強。這些發現為局部力學通過調節局部免疫環境間接重塑早期血管形成提供了證據。

最后，通過前述的成骨試驗評估機械激活的 M1 極化巨噬細胞分泌組的成骨再生特性。暴露于機械刺激 M1 巨噬細胞條件培養基的人 MSCs 顯示出 RUNX2 適度但不顯著的增加（圖4 A），同時未影響軟骨生成 SOX9 水平，因此與靜態 CM 對照相比，RUNX2/SOX9 比率呈上升趨勢，盡管不顯著。這些結果表明，hMSCs 早期成骨譜系承諾可能向 M2a 樣表型轉變（圖4 A），進一步體現在負荷 M1 CM 處理后 BMP-2 mRNA 水平的顯著下降。

為了研究骨形成的長期影響，進行了前述的14天礦化分析，觀察到 hMSCs 的增殖和 ALP 蛋白生成均未顯著變化。此外，雖然 5% 預負荷巨噬細胞分泌組能夠推動骨生成基因表達的微小變化，但這并未轉化為后續礦化結果，這一點從與靜態對照 CM 相比鈣沉積變化不顯著所證明（圖4 B）。這些結果表明，適度負荷優先調控修復早期階段，通過靶向巨噬細胞表型和早期血管形成，而在受損環境中對后期成骨作用影響有限。

圖4     較低的動態壓縮負荷對通過調節高度炎癥性巨噬細胞分泌組對骨沉積的后續協調影響有限。

圖5    圖形概要

利用該模型，該研究證明，巨噬細胞對壓縮負荷強度具有響應性且敏感性，中等負荷（5%應變）會產生再生巨噬細胞混合表型和分泌組，而高度負荷（35%應變）則產生對血管生成和骨生成不利的分泌組。此外，中等幅度應變還可以抑制炎癥性受損骨折模型中的炎癥。總之，該研究提供了有力證據，表明局部機械線索對巨噬細胞具有強大的免疫調節作用，這有助于理解局部固定器剛度對骨折修復的影響，并最終證明了一種調節骨缺損早期免疫反應的新方法。

參考文獻：Petrousek SR, Kronemberger GS, O'Brien G, Hughes C, O'Rourke SA, Lally C, Dunne A, Kelly DJ, Hoey DA. Mechano-immunomodulation of macrophages influences the regenerative environment of fracture healing through the regulation of angiogenesis and osteogenesis. Acta Biomater. 2025 Jun 15;200:187-201. doi: 10.1016/j.actbio.2025.05.045. Epub 2025 May 21. PMID: 40409508.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40409508/

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