機械應力誘導心臟成纖維細胞早衰

Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts

Keywords: cellular senescence; mechanical stress; mechanosensitivity; nuclear integrity.

細胞衰老是一種細胞周期停滯狀態(tài)，在發(fā)育和損傷后的組織形成和重塑中發(fā)揮作用。定義衰老的最廣泛認可的標志物是通過細胞周期停滯信號，特別是小鼠的 p16/p19（或人類的 p16/p14）和 p53/p21。新出現(xiàn)的證據表明，機械刺激和微環(huán)境的改變可能是啟動早衰樣狀態(tài)的另一個因素。隨著在創(chuàng)傷和疾病中觀察到的長期暴露于物理應力或拉伸應變，細胞和細胞核會發(fā)生直接變化，從而影響一系列生物標志物。然而，如果細胞應力繼續(xù)超出正常生理范圍，則可能出現(xiàn)應激誘導的過早衰老表型。這種表型與癌癥、骨關節(jié)炎和心血管疾病等病理狀態(tài)有關。值得注意的是，這些疾病狀態(tài)通常會導致組織中生化和機械環(huán)境的變化，表明衰老可能是由多種因素共同引起的。

心臟成纖維細胞（CFs）是心臟組織中對環(huán)境信號參與適應性反應的主要細胞類型之一。研究表明， CF 的表型可塑性通過機械敏感反應，在生物化學上由鈣信號介導，在生物物理上由α-SMA增加介導。此外，已知拉伸幅度和基質剛度的改變會將 CFs 激活為肌成纖維細胞表型。衰老的心肌細胞由于細胞收縮力下降而導致收縮頻率增加，從而表現(xiàn)出收縮功能障礙。CFs 嵌套在心肌細胞之間，被動地經歷這種收縮功能障礙，表明心肌細胞和 CFs 之間存在連續(xù)串擾。

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基于此，美國科羅拉多大學博爾德分校機械工程系及生物醫(yī)學工程項目團隊使用體外模型模擬心臟病中的機械破壞，旨在通過檢測細胞衰老標志物以確定擾動機械刺激是否可以在小鼠原代 CFs 中觸發(fā)應激誘導的早衰表型。由于核膜結構完整性的改變和氧化應激的增加與幾種類型的心血管疾病有關，還進一步研究了氧化應激和核纖層蛋白A/C 突變對 CFs 的衰老反應。研究分析表明，早衰表型可以由機械環(huán)境中的擾動單獨啟動，與化學誘導相比是獨特的。研究成果發(fā)表于Advanced Science 期刊題為“Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts”。

首先，為了檢查擾動機械刺激對心臟成纖維細胞（CFs）的作用，對小鼠原代野生型（WT）CFs進行兩種循環(huán)拉伸模式持續(xù)4天（圖1 A）。第一種模式稱為對照拉伸（1 Hz，8.5%），第二種模式稱為損傷拉伸，它模仿了心臟病中觀察到的機械負荷變化，在1 Hz，8.5% 應變持續(xù)24 小時，然后幅度降低到2.5% 應變，頻率增加到2 Hz（圖1 B）。4天（96小時）后，使用標記細胞周期 G1、G2 和 S 期細胞的 Ki-67，與對照拉伸 CFs 相比，損傷拉伸組 CFs 顯示 Ki-67 歸一化強度值顯著降低（圖1 C），這與增殖能力降低和細胞周期停滯一致，是衰老的標志。

同時，評估了損傷拉伸組 CFs 的其他衰老特征，如核纖層蛋白B 的表達、核形態(tài)的改變、DNA 損傷和細胞周期停滯標志物的基因表達。在體內和體外衰老細胞中觀察到核纖層蛋白 B 減少。此外，損傷拉伸組 CFs的核面積顯著增加，但沒有觀察到核長寬比的變化。γH2A.X 焦點的 DNA 損傷，是在應激引起的早衰中常見的雙鏈斷裂（DSB）的標志物。通過γH2A.X的存在測量DNA損傷，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，損傷拉伸CFs中每個細胞核的γH2A.X焦點顯著增加，這提供了一種觸發(fā)衰老狀態(tài)啟動的信號機制。已知 p53-p21-RB 軸參與 DNA 損傷反應信號和細胞周期停滯。RT-qPCR 結果顯示，損傷拉伸組 CFs 的 p53 和 p21 表達增加，但令人驚訝的是 p16 的表達降低。這些數(shù)據表明，通過細胞周期、核形態(tài)和 DNA 損傷的標記進行評估時，小鼠原代 CFs的機械擾動會誘導衰老樣表型。

圖1     機械負荷的改變會破壞原代心臟成纖維細胞的細胞周期和增殖。

考慮到定義衰老表型需要多種標志物的組合，而且有幾種標志物不是衰老du有的，研究人員試圖通過氧化應激、活性氧（ROS）誘導的衰老來額外誘導衰老表型。使用過氧化氫處理原代 WT CFs 超過 21 天，以化學誘導衰老。結果發(fā)現(xiàn)。與組織培養(yǎng)板（TCP）對照相比，ROS誘導的CFs的Ki-67染色顯著減少，表明增殖減少。同時，ROS誘導的CFs 核纖層蛋白B 環(huán)厚度減少（圖2 A），強度普遍降低，核面積顯著增加（圖2 B）。通過γH2A.X焦點計數(shù)檢查了ROS誘導的衰老CFs是否增加DNA損傷，發(fā)現(xiàn)TCP和ROS誘導的CFs之間沒有差異（圖3 C）。p53 和 p21 的基因表達分析支持了 γH2A.X 焦點沒有顯著差異，與 TCP 對照相比，這兩個基因都有所減少（圖2 D）。與機械誘導的衰老CFs相似，p38基因表達沒有差異。然而，ROS 誘導的 CFs 顯示出 p16 表達的增加。

上述研究表明，機械誘導的衰老樣CFs表現(xiàn)出與ROS誘導的CFs相似的衰老特征，即增殖下降（即Ki-67），核纖層蛋白B減少，核面積增加。然而，兩種誘導模式可能有其獨特的途徑，且取決于機械刺激與生化刺激。雖然兩種處理都顯示出細胞周期停滯標志物的表達增加，但 ROS 誘導的 CFs 表現(xiàn)出顯著的 p16 上調，而機械誘導的 CFs 表現(xiàn)出 p53 和 p21 表達的增加。

圖2    氧化應激下的心臟成纖維細胞表現(xiàn)出化學誘導衰老表型標志物，包括形態(tài)、DNA 損傷和基因表達的改變。

由于在衰老細胞中發(fā)現(xiàn)的許多改變和標記與細胞核和核膜的變化重疊，實驗假設核膜中的機械敏感蛋白可能會放大衰老樣表型的啟動。因此，從4-9周齡的核纖層蛋白A/C缺失小鼠中建立了CFs的原代培養(yǎng)物，暴露于對照拉伸和損傷拉伸的加載條件下。結果觀察到，與對照拉伸 CF 相比，損傷拉伸 CF 中的 Ki-67 分布顯著降低（圖3 A），核面積或縱橫比沒有變化（圖3 B），核纖層蛋白B 環(huán)厚度增加（圖3 C），這可能是在核纖層蛋白 A/C 缺失情況下的一種代償機制。檢查 CFs 中的 DNA 損傷反應，觀察到 γH2A.X 焦點增加（圖3 D），但基因表達分析未顯示 p53 或 p21 的顯著差異。雖然沒有觀察到核纖層蛋白 B 環(huán)厚度的減少，這將證實衰老樣表型，但實驗注意到機械刺激（對照和損傷拉伸）下核纖層蛋白 A/C 缺失的 CFs 中核破裂和核纖層蛋白B 稀釋區(qū)域的增加，這表明沿核膜的核纖層蛋白 A/C 的缺失降低了結構完整性。這表明，形態(tài)學讀數(shù)、基因表達和 DNA 損傷的總體變化并不表明過早衰老狀態(tài)的進展是由于核纖層蛋白 A/C 的丟失而改變的核結構完整性而放大的。

圖3     通過核纖層蛋白 A/C 丟失破壞核完整性不會放大心臟成纖維細胞中機械誘導的早衰表型。

由于上述過程沒有觀察到核纖層蛋白A/C 缺失的 CFs 的放大表型，最后，實驗觀察了核膜中其他機械敏感的蛋白質。Emerin 是一種核膜蛋白，與核纖層蛋白A/C 緊密相互作用，調節(jié)核的力學性質和信號傳導。研究發(fā)現(xiàn)，應變增加會導致 Emerin 定位到外核膜。使用相同的拉伸方案來啟動機械誘導的衰老表型（圖1 B），發(fā)現(xiàn)與對照拉伸CFs 相比，損傷拉伸CFs 的 Emerin環(huán)厚度顯著降低（圖 4 A）。

這一發(fā)現(xiàn)是否適用于所有的衰老CFs，量化 ROS 誘導和 TCP 誘導的CFs 中的Emerin環(huán)厚度，并沒有發(fā)現(xiàn)化學誘導的衰老 CFs 的改變（圖 4 B）。在所有核纖層蛋白 A/C 缺失細胞中，無論是機械刺激還是化學刺激，都測量到Emerin環(huán)厚度的減少，但兩者未發(fā)現(xiàn)顯著差異。這并不奇怪，因為核纖層蛋白 A/C 缺失 CFs 中的Emerin定位已被證明主要定位在細胞質上。此外，隨著Emerin環(huán)厚度的減小，還定性地觀察到緊鄰核膜周圍的不規(guī)則肌動蛋白結構模式。這些結果表明，機械敏感蛋白 Emerin 會隨著損傷性拉伸而減少，Emerin定位是機械誘導衰老的一個顯著特征，突出了它作為核結構完整性的機械敏感調節(jié)劑的作用及其與衰老表型誘導的相互作用。

圖4    機械敏感核膜蛋白 Emerin 可能是心臟成纖維細胞中啟動機械誘導衰老表型的關鍵介質。

總之，這項研究檢查了在心臟病的簡化體外模型中，擾動的機械刺激如何觸發(fā)細胞衰老的啟動。利用先前建立的細胞衰老標志物，研究發(fā)現(xiàn)擾動力刺激可以改變增殖、核纖層蛋白 B 表達、誘導 DNA 損傷反應以及 p21 和 p53 表達的增加，從而定義 CFs 中機械誘導的衰老特征。此外，還發(fā)現(xiàn) Emerin （一種核膜中的機械敏感蛋白質）可能在起始階段參與其中。該研究證明了機械刺激的生理變化，更具體地說，應變幅度的降低和頻率的增加如何引發(fā)細胞衰老，從而推進了更精確定義細胞衰老的嘗試。

參考文獻：Schneider SE, Scott AK, Gallagher KM, Miller EY, Ghosh S, Neu CP. Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts. Adv Sci (Weinh). 2025 Sep 26:e13314. doi: 10.1002/advs.202513314. Epub ahead of print. PMID: 40999893.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40999893/

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