大鼠小膠質細胞提取與分選攻略

一、實驗前準備
1、動物：新生 1–3d SD 大鼠乳鼠全腦（含皮質、海馬、紋狀體）。
2、主要試劑
• DMEM（abs9483）
• 胎牛血清（abs972）
• 雙抗（abs9244）
• 0.25 % 胰蛋白酶-EDTA（abs47014938）
• 組織解離液（abs9482）
• 10xPBS（abs961）
• 1xPBS（abs962）
• Percoll（abs9102）
• 70um 細胞篩網（abs7232）
• 細胞培養皿（35mm）（abs7004）
• 細胞培養皿（60mm）（abs7005）

二、小膠質細胞提取與分選
1、酶消化
（1）將腦組織剪碎成 0.5-1mm3 的小組織塊，將組織塊（100-200mg）轉移到 2mL圓底管中，加入1mL 消化液（cat: abs9482），37℃水平搖床 80rpm 的速度輕輕搖動孵育30-40min（根據組織糜爛狀態適當延長時間）
（2）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋管 10-20s，通過 70um 細胞篩網（cat: abs7232）過濾，用 10mL PBS 沖洗細胞篩網;
（3）收集含有細胞的濾液到 50mL 管中，20℃下400g離心5min，棄上清。

2、Percoll 密度梯度純化
（1）30% Percoll 溶液
Percoll 細胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液。
用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 3:7 混合，配制 30%等滲 Percoll 溶液。
（2）37% Percoll 溶液
Perco11 細胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 37:63混合，配制 37%等滲 Percoll 溶液
（3）70% Percoll 溶液
Perco11 細胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 7:3混合，配制 70%等滲 Percoll 溶液；
（4）吸取 4 mL 70% percoll 深入 到 15mL 離心管底部；
（5）用 4mL，37%percoll （cat: abs9102）重懸細胞沉淀，沿著管壁緩慢加入含4mL 50% percoll 離心管中，覆蓋在 70% Percol 溶液的頂部形成密度梯度；
▲注意：不要破壞 37% Percoll和 70% Percoll 與細胞的懸液的分界面，37%和 70% percoll 現配現用。
（6）吸取 4mL 30% percoll，沿著管壁緩慢15mL 離心管中，覆蓋在 37% Percoll細胞溶液的頂部形成密度梯度；
（7）900xg，20℃，離心 45min，升速(ACC)1，降速(DEC)1；
（8）離心結束后，吸取中間 37% 與70% Percoll界面層細胞（富含 TC）至新的 15mL 離心管中，加入3倍體積 4℃預冷 1xPBS，上下顛倒混勻， 4℃下 400g離心 5min，棄上清；
（9）按照步驟（8）重復清洗一次，棄上清得到細胞。

三、培養與傳代
（1）培養基：DMEM + 10% FBS + 1% 雙抗。
（2）每 2–3 天換液；細胞長至 80% 匯合時，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1–2min，1:3傳代。
（3）前 3 代以內功能最穩定，建議實驗在此窗口內完成。 

四、注意事項
1、消化時間勿超 90min，以免降低活率。
2、Percoll 離心后收細胞時，界面層需精準吸取，避免混入紅細胞或顆粒細胞。

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