RAYPA培養基自動制備分裝儀在克羅諾桿菌定量檢驗中的應用

方案摘要：本方案基于MPN法原理開展克羅諾桿菌定量檢驗，核心引入RAYPA培養基自動制備分裝儀優化流程。該儀器以一體化滅菌、精準控溫及定量分裝優勢，制備厚度均一的顯色培養基平板，降低污染風險與人為誤差。實驗通過BPW前增菌、mLST-Vm選擇性增菌后，用儀器制備的顯色培養基分離可疑菌落，經TSA純化及生化鑒定確證。依據陽性管數查MPN檢索表，報告100g(mL)樣品MPN值。RAYPA儀器實現培養基制備標準化，較傳統方式效率大大提升，同時提升無菌性與均一性，為檢驗結果精準性提供核心保障。
 
方案詳情：

• 實驗原理

克羅諾桿菌定量檢驗基于 MPN（最大可能數）法原理，結合選擇性增菌、特異性分離及精準鑒定實現定量。先以 BPW 培養基前增菌，為少量目標菌提供生長環境；再用 mLST-Vm 選擇性培養基抑制雜菌、富集目標菌。借助顯色培養基分離可疑菌落，挑取后經 TSA 純化，通過生化反應驗證典型特征，可選 PCR 靶向 ITS 區域確認。最終依據不同稀釋度陽性管數查 MPN 檢索表，報告 100g (mL) 樣品中目標菌 MPN 值。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 恒溫培養箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無菌培養皿:直徑90mm；
⑨ pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機:轉速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統或紫外檢測儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細管電泳儀；
⑮ PCR反應管；
⑯ RAYPA培養基自動制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養基；
⑧ L-鳥氨酸脫羧酶培養基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養基；
⑩ 糖類發酵培養基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養基；
⑫ 克羅諾桿菌質控菌株；
⑬ 大腸埃希氏菌質控菌株；
 
三、實驗步驟
1、取檢樣100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份，分別置于2000mL、200mL、100mL無菌容器中，對應加入900mL、90mL、9mL已通過恒溫水浴箱預熱至41℃±1℃的BPW培養基。將容器置于振蕩器上輕柔振蕩5~10min，確保檢樣充分溶解并與培養基混勻，制成1:10樣品勻液。將上述勻液置于36℃±1℃恒溫培養箱中培養18h±2h，完成前增菌。前增菌結束后，輕柔搖動容器使培養物混勻，用無菌1mL移液管精準吸取1mL前增菌液，轉入含10mL mLST-Vm肉湯的無菌容器中，每個稀釋度做3個平行管。將所有接種后的mLST-Vm肉湯容器置于41.5℃±1℃恒溫培養箱中培養24h±2h，完成選擇性增菌。
 
2、分離培養
① 提前啟動RAYPA培養基自動制備分裝儀，按照克羅諾桿菌顯色培養基配方加入干粉培養基與適量無菌水，儀器自動完成加熱融化及滅菌。待培養基滅菌后，儀器自動冷卻至45℃以下并精準分裝至無菌培養皿中，分裝完成后自然凝固備用。此過程全程密閉操作，有效減少人工干預導致的污染風險，且每皿培養基體積、厚度均一，保障后續菌落生長的一致性。混勻mLST-Vm肉湯培養物，用Pipetty電動移液器精準吸取10μL培養物，分別在2個提前制備好的克羅諾桿菌顯色培養基平板上進行劃線接種。接種完成后，將平板倒置放入36℃±1℃恒溫培養箱中培養24h±2h。
 
② 菌落純化：根據克羅諾桿菌顯色培養基的判定標準（如特定顏色、形態菌落）挑取可疑菌落，每個平板至少挑取5個（若不足5個則全部挑取）。使用無菌接種環挑取可疑菌落，分別劃線接種于TSA平板上，置于36℃±1℃恒溫培養箱中培養24h±2h，獲得純化菌落備用。
3、選取TSA平板上純化后的菌落進行生化鑒定，優先選取克羅諾桿菌顯色培養基上最具典型特征菌落對應的純化菌落。用無菌接種環挑取新鮮傳代的純化菌落，按照微生物生化鑒定試劑盒說明書及關鍵生化指標檢測要求，依次進行氧化酶試驗、脫羧酶試驗、糖類發酵試驗及西蒙氏檸檬酸鹽試驗等。若首個典型菌落生化鑒定為陽性，則可判定該樣品檢出克羅諾桿菌，無需進一步鑒定其他菌落；若首個菌落為陰性，則依次選取其他純化菌落進行鑒定，直至所有挑取菌落均為陰性（判定未檢出）或出現陽性菌落（判定檢出）。對于需精準溯源的場景，可選取陽性菌落進行PCR靶向ITS區域檢測，進一步確認菌株身份。克羅諾桿菌的主要生化特征見表3。
 
四、結果報告
綜合克羅諾桿菌顯色培養基上的菌落特征及生化確證試驗結果，統計各稀釋度對應的mLST-Vm選擇性增菌陽性管數。根據陽性管數查閱MPN檢索表，計算并報告100g(mL)樣品中克羅諾桿菌的MPN值。若所有稀釋度均未檢出陽性管，報告為“克羅諾桿菌未檢出”。